溶磷和pH值對殺真菌素鏈霉菌合成恩拉霉素的影響

劉鐵軍,李 炯

(河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司,河北石家莊 051430)

溶磷和pH值對殺真菌素鏈霉菌合成恩拉霉素的影響

劉鐵軍,李 炯

(河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司,河北石家莊 051430)

研究了培養(yǎng)基滅菌后溶磷和發(fā)酵過程pH值等對殺真菌素鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus)J Z-14-056D3合成恩拉霉素的影響,通過發(fā)酵尾氣成分的測量和OUR,DO等參數(shù)的分析,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基滅菌后溶磷質(zhì)量濃度控制在0.65μg/mL,控制發(fā)酵過程pH值為7.0,192 h發(fā)酵單位最高可達(dá)5 710 U/mL。

恩拉霉素;發(fā)酵;pH值;溶磷

恩拉霉素(enramycin)又名持久霉素(enduracidin),是殺真菌素鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus)發(fā)酵得到的由一個不飽和脂肪酸與十幾種氨基酸結(jié)合的多肽類畜用抗生素,主要組分有恩拉霉素A和B(兩者的比例約為7∶3)。該抗生素于1966年由日本武田藥品工業(yè)株式會社研發(fā),1974年在日本正式注冊,其后在許多國家被注冊和廣泛使用[1]。它對革蘭氏陽性菌有很強(qiáng)的抑制作用,特別對腸道有害菌梭菌的抑制作用較強(qiáng),長期使用后不易產(chǎn)生耐藥性。它能改變腸道內(nèi)的細(xì)菌群落分布,有利于飼料營養(yǎng)成分的消化吸收,促進(jìn)動物增重和提高飼料利用率,因此被世界上許多國家推薦作為抗生素促生長劑。

磷酸鹽是微生物氧化磷酸化反應(yīng)底物,對微生物的生長與初級代謝起著重要作用。但在次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)中,所需要的磷酸鹽濃度較低,平均濃度僅為1.0 mmol/L,提高至10 mmol/L就會明顯抑制次級代謝產(chǎn)物的合成[2]。

發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值對微生物生長和代謝也具有非常明顯的影響[3]。不同微生物的生長和產(chǎn)物合成各有其適合的pH值范圍。

發(fā)酵過程的攝氧率(OUR)及溶氧(DO)是微生物細(xì)胞生長與代謝強(qiáng)度的度量,是分析和控制發(fā)酵過程的重要指標(biāo)。

本研究通過利用氣體質(zhì)譜儀分析發(fā)酵過程中尾氣CO2和O2等濃度的變化,計(jì)算和分析發(fā)酵過程的OUR,并結(jié)合DO和菌濃變化,系統(tǒng)優(yōu)化控制發(fā)酵過程,使發(fā)酵產(chǎn)量有了一定程度的提高。

1 材料與方法

1.1 菌種

殺真菌素鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus)JZ-14-056D3,為河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司自選菌種。

1.2 培養(yǎng)基

種子罐培養(yǎng)基(均以質(zhì)量濃度表示):玉米粉10 g/L,淀粉 20 g/L,大豆油 3 g/L,硫酸銨 2.5 g/L,KH2PO40.9 g/L,泡敵 0.04 g/L 。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基(均以質(zhì)量濃度表示):葡萄糖40 g/L,玉米粉40 g/L,玉米蛋白粉25 g/L,棉籽餅粉10 g/L,硫酸銨17.8 g/L,泡敵0.04 g/L。

發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基:40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))淀粉溶液。

1.3 培養(yǎng)條件

種子罐:溫度為(30±0.5)℃;培養(yǎng)時(shí)間為24 h;罐壓為0.02 MPa;通氣比為1∶1;轉(zhuǎn)速為600 r/min;接種量為1.5%(體積分?jǐn)?shù));種子罐體積為15 L;裝液量為70%(體積分?jǐn)?shù))。

發(fā)酵罐:溫度為(30±0.5)℃;培養(yǎng)時(shí)間為180 h;罐壓為0.02 MPa;通氣比為1∶1;轉(zhuǎn)速在600 r/min以內(nèi),根據(jù)溶氧狀況進(jìn)行調(diào)節(jié);接種量為10%(體積分?jǐn)?shù));發(fā)酵罐體積為50 L;裝液量為70%(體積分?jǐn)?shù))。

當(dāng)種子罐培菌濃不低于25%(體積分?jǐn)?shù)),pH值持續(xù)下降,鏡檢菌絲為舒展網(wǎng)狀,將種子以壓差法移入發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。發(fā)酵罐滅菌后培養(yǎng)基總糖為73～76 g/L,50 h后通過補(bǔ)料控制總糖為15～25 g/L。

1.4 分析方法

1.4.1 效價(jià)測定

單獨(dú)采用HPLC法測定發(fā)酵液效價(jià)。流動相:0.05 mol/L的乙腈與磷酸二氫鈉體積比為3∶7,用磷酸調(diào)pH值至4.5。采用色譜柱waters C18,流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為20μL,檢測波長為267 nm,運(yùn)行時(shí)間為20 min。

1.4.2 化學(xué)分析

溶磷采用鉬酸比色法[4],總糖采用菲林法[5]進(jìn)行分析測定。

1.4.3 發(fā)酵尾氣分析

采用質(zhì)譜儀采集發(fā)酵過程尾氣,分析 O2和CO2等的變化,計(jì)算OUR。

2 所用儀器設(shè)備

15 L,50 L發(fā)酵罐為揚(yáng)中威柯特生物工程設(shè)備公司提供;氣體質(zhì)譜儀為英國海登公司提供的HPR20型質(zhì)譜儀;液相色譜儀為Cometro 6000高效液相色譜系統(tǒng)。

3 試驗(yàn)內(nèi)容

3.1 滅菌后溶磷

根據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中 KH2PO4添加量,滅菌后將溶磷質(zhì)量濃度分別控制在0.20,0.65,0.95,1.50 μg/mL共4個梯度。

3.2 pH值控制梯度

通過加入不同量的氨水,分別將發(fā)酵過程的pH值控制在6.5,6.8,7.0和7.2共4個梯度。

4 結(jié)果與討論

4.1 滅菌后溶磷濃度(以質(zhì)量濃度計(jì),下同)的確定

4.1.1 不同滅菌后溶磷濃度下的DO,OUR和效價(jià)(考察前50 h)(見圖1和表1)

圖1 滅菌后不同溶磷濃度下DO和OUR變化曲線Fig.1 Dissolved oxygen and OUR curve in different dissolved phosphate concentrations after sterilization

表1 滅菌后不同溶磷濃度下起步效價(jià)表Tab.1 Initial titer in different dissolved phosphate concentrations after sterilization

從圖1(其中,數(shù)字代表滅菌后不同溶磷質(zhì)量濃度:1為0.20μg/mL;2為 0.65μg/mL;3為0.95 μg/mL;4為1.50μg/mL)和表1中可以看出,隨著培養(yǎng)基滅菌后溶磷濃度的提高,發(fā)酵過程中DO下降加快,OUR也隨之快速提高,但是當(dāng)滅菌后溶磷質(zhì)量濃度為0.95μg/mL和 1.50μg/mL時(shí)出現(xiàn)DO繼續(xù)下降至20%以下,而OUR也隨之下降的現(xiàn)象,出現(xiàn)OUR和DO同時(shí)下降,及DO已經(jīng)低于臨界氧濃度以下,導(dǎo)致OUR下降[6],也就是說需要控制的臨界氧濃度不能低于20%。同時(shí)結(jié)合效價(jià)可知,高的滅菌后溶磷濃度可以提高起步效價(jià),但是效價(jià)漲幅在0.65μg/mL時(shí)最大,這就說明雖然高的滅菌后溶磷濃度雖然能較快消耗DO,提高起步效價(jià),但是由于DO很快達(dá)到臨界值以下,使得發(fā)酵效價(jià)并沒有相應(yīng)提高。

4.1.2 滅菌后不同溶磷濃度下的糖耗變化(見圖2)

圖2 滅菌后不同溶磷濃度的總糖變化曲線Fig.2 Total sugar curve in different dissolved phosphate concentrations after sterilization

圖2中,數(shù)字代表滅菌后不同溶磷質(zhì)量濃度:1為0.20μg/mL;2為 0.65μg/mL;3為 0.95μg/mL;4為1.50μg/mL。

由圖2可以看出在滅菌后不同溶磷濃度下均在10 h出現(xiàn)總糖的消耗,但是隨著滅菌后溶磷濃度的提高耗糖快速期也隨著提前:當(dāng)滅菌后溶磷濃度在0.20μg/mL時(shí),總糖50 h下降到25 g/L;當(dāng)滅菌后溶磷濃度在0.65μg/mL時(shí),總糖40 h下降到25 g/L;當(dāng)滅菌后溶磷濃度在0.95μg/mL時(shí),總糖40 h下降到18 g/L,之后變化不大;當(dāng)滅菌后溶磷濃度在1.50μg/mL時(shí),總糖40 h達(dá)到17 g/L,之后變化不大。但當(dāng)DO低于20%時(shí)糖耗速率也隨之下降。

4.2 發(fā)酵過程pH值的控制

發(fā)酵過程中pH值持續(xù)下降,但合成恩拉霉素需要一個合適的pH值范圍,因此在40 h后通入氨水對pH值加以調(diào)控,保證恩拉霉素的合成。

4.2.1 不同pH值下的溶氧變化(見圖3)

圖3 不同pH值下DO變化曲線Fig.3 DO curve in different pH

由圖3可知,在加入氨水控制pH值之前DO變化基本相同,但在此之后DO出現(xiàn)不同變化:當(dāng)pH值控制在6.5時(shí)DO高于其他條件下的DO值達(dá)30%以上;當(dāng)pH值為7.0時(shí)DO為最低,基本在20%左右;當(dāng)pH值在6.8和7.2時(shí),DO基本相同,維持在25%左右。

4.2.2 不同pH值下OUR變化(見圖4)

圖4 不同pH值下OUR曲線Fig.4 OUR curve in different pH

由圖4可以看到,pH值為6.5時(shí),產(chǎn)物積累期菌體的OUR水平較低,發(fā)酵后期菌體OUR下降速度快;pH值在6.8和7.2時(shí),產(chǎn)物積累期的OUR比較平穩(wěn),后期下降平緩;而pH值在7.0時(shí)上升速度快,產(chǎn)物積累的OUR高且平穩(wěn),發(fā)酵后期菌體OUR則有所下降。由此可見,pH值水平控制在7.0時(shí),有利于菌體維持適當(dāng)?shù)幕盍Α?/p>

4.2.3 不同pH值下效價(jià)變化(見圖5)

48 h不測放罐效價(jià),圖5中取值為0。由圖5可以發(fā)現(xiàn),在開始通氨水時(shí)并不影響發(fā)酵單位,起步效價(jià)基本相同,均在250～260 U/mL左右,但是pH值持續(xù)控制之后,效價(jià)增長幅度明顯拉開,當(dāng)pH值為6.5時(shí)效價(jià)漲幅最慢,每24 h基本維持800 U/mL,放罐效價(jià)較低;當(dāng)pH值控制在7.0時(shí)效價(jià)漲幅最高,每24 h達(dá)到1 200 U/mL,放罐效價(jià)最高;當(dāng)pH值控制在6.8和7.2時(shí),都相對較高,但是pH值在7.2時(shí)的效價(jià)漲幅要高于pH值在6.8時(shí),因此確定pH值控制在7.0～7.2為宜。

圖5 不同pH值時(shí)的效價(jià)曲線Fig.5 Titer curve in different pH values

5 結(jié) 論

對殺真菌素鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus)JZ-14-056D3在不同溶磷質(zhì)量濃度和pH值下菌體的代謝活性(OUR和DO變化)和效價(jià)增長情況進(jìn)行了考察。菌體在初始溶磷質(zhì)量濃度為0.65 μg/mL,發(fā)酵過程pH值控制在7.0～7.2,DO≥20%時(shí),恩拉霉素的合成水平最高,為5 710 U/mL。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出,pH值和溶磷質(zhì)量濃度的變化對恩拉霉素的合成有著較為顯著的影響。

隨著溶磷質(zhì)量濃度的升高DO下降速率加快,菌體的初始代謝活性增強(qiáng)(表現(xiàn)為隨著溶磷質(zhì)量濃度的提高,OUR逐漸上升),菌體在更短的時(shí)間內(nèi)積累大量的前體物,為后期發(fā)酵效價(jià)的產(chǎn)生提供了足夠的生物量,這有利于生產(chǎn)期恩拉霉素的大量合成。但隨著生物量的提高,發(fā)酵過程臨界氧濃度出現(xiàn)的時(shí)間提前,并且持續(xù)時(shí)間更長,這種情況造成了菌體代謝途徑的改變,發(fā)生了代謝異常,阻礙了恩拉霉素的合成效率。因而,初始溶磷質(zhì)量濃度的控制對于抗生素的產(chǎn)生起著重要的作用。

發(fā)酵液pH值的變化影響著菌體的生長和抗生素合成相關(guān)酶類的活性,因而,菌體生長的最適宜pH值和抗生素合成的最適宜pH值不一定相同。通過對菌體代謝活性和抗生素產(chǎn)生情況的考察,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液的pH值維持在7.0時(shí)菌體的代謝活性和效價(jià)產(chǎn)生速率均達(dá)到了最高,這表明菌體的初級和次級代謝的最適宜pH值相同。

[1]周岷江,嚴(yán)玉寶,胡 娟,等.恩拉霉素的研究進(jìn)展[J].中國獸藥雜志,2007,41(12):42-44.

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[6]張嗣良,儲 炬.多尺度微生物過程優(yōu)化[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2003.

Investigation for effects of dissolved phosphate and pH on producing enramycin byStreptomyces fungicidicusJZ-14-056D3

LIU Tie-jun,LI Jiong
(Hebei Shengxue Dacheng Pharmaceutical Company Limited,Shijiazhuang Hebei 051430,China)

This paper investigated the effects of dissolved phosphate concentration and pH in the fermentation medium after sterilization on the production of enramycin byStreptomyces fungicidicusJZ-14-056D3.Through the assaying of off-gas and analysis of OUR and DO,it is found that the yield of enramycin can reach 5 710 U/mL in 192 h when the dissolved phosphate concentration in the medium is 0.65μg/mL and the pH is 7.0.

enramycin;fermentastion;pH values;dissolved phosphate

TQ465.6

A

1008-1534(2011)04-0233-03

2011-03-23;

2011-04-06

責(zé)任編輯:王海云

劉鐵軍(1970-),男,河南南陽人,高級工程師,主要從事抗生素發(fā)酵方面的研究。