蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白分離純化新方法研究

楊開(kāi)杰

(邢臺(tái)廣播電視大學(xué)理工系,河北邢臺(tái) 054000)

蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白分離純化新方法研究

楊開(kāi)杰

(邢臺(tái)廣播電視大學(xué)理工系,河北邢臺(tái) 054000)

分離蘇云金芽孢桿菌(Bt)晶體蛋白常用的方法有液體雙相法、密度梯度法、沉淀法、生物-物理分離法等,但這幾種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。從分離成本、儀器設(shè)備、純度、產(chǎn)量、活性等方面考慮,在超聲波處理、懸液制備和紫外線輻射3個(gè)方面進(jìn)行了改進(jìn),提出了一種新的分離Bt晶體蛋白的方法,產(chǎn)品純度可達(dá)90%以上,產(chǎn)率從原來(lái)的20%提高到28%。本方法成本低,產(chǎn)率高,操作簡(jiǎn)單,具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

蘇云金芽孢桿菌;分離純化;晶體蛋白

蘇云金芽孢桿菌(bacillus thuringiensis,Bt)是一種綠色生物農(nóng)藥,屬于微生物殺蟲(chóng)劑,其有效殺蟲(chóng)成分是伴孢晶體和芽孢。由于Bt具有對(duì)病蟲(chóng)害防治效果好、對(duì)人畜安全無(wú)毒、不污染環(huán)境、不殺害天敵等優(yōu)良品質(zhì)而倍受青睞,全世界年產(chǎn)值已突破1億美元,并且以每年10%～20%的速度上升[1]。為了更深刻地了解Bt農(nóng)藥的殺蟲(chóng)機(jī)理及其基因表達(dá),從Bt中分離純化有效成分伴孢晶體則十分重要[2]。目前常用的分離純化方法有雙相法、密度梯度法、沉淀法、生物-物理分離法,這些方法在晶體蛋白的質(zhì)量和產(chǎn)量、實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性等方面各有優(yōu)缺點(diǎn)。常用的四氯化碳-硫酸鈉雙相法盡管產(chǎn)量比較高,所用試劑價(jià)廉,儀器簡(jiǎn)單,但純度不夠,試劑毒性比較大,操作不方便。密度梯度法常用的是泛影葡胺梯度離心法,能獲得純度較高的晶體,但產(chǎn)量較低,試劑及實(shí)驗(yàn)條件要求比較嚴(yán)格。沉淀法試劑便宜,產(chǎn)品純度高,但操作繁瑣,產(chǎn)率低。生物-物理分離法試劑昂貴,實(shí)驗(yàn)條件苛刻,產(chǎn)率低[3]。在前人工作的基礎(chǔ)上,筆者對(duì)超聲波處理?xiàng)l件、離心條件、試劑選擇等方面進(jìn)行了改進(jìn),建立了一種新的Bt伴孢晶體分離純化方法,收到了比較理想的效果。

1 材料、設(shè)備與方法

1.1 材料和設(shè)備

材料:Bt,中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心提供;牛肉膏,胰蛋白胨,酵母膏,葡萄糖,瓊脂,磷酸氫二鈉,北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠提供;聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司提供;溴化鈉,天津化學(xué)試劑三廠提供;小菜蛾,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物所,在培養(yǎng)箱中于25℃養(yǎng)育繁殖。

主要設(shè)備:數(shù)顯光照培養(yǎng)箱,磁力攪拌器,座式電熱壓力蒸汽消毒器,SW-CJ-FD型凈化工作臺(tái),YS2-H生物顯微鏡,SIGMA離心機(jī),J Y92型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),L GJ臺(tái)式冷凍干燥機(jī)。

1.2 方 法

1.2.1 菌體的固體培養(yǎng)

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的組成如下:牛肉膏3 g,蛋白胨 10 g,氯化鈉 5 g,瓊脂 15～20 g,去離子水1 000 mL,pH值為7.4～7.6。使用此培養(yǎng)基,進(jìn)行斜面活化接種,在培養(yǎng)箱中于37℃固體培養(yǎng)24 h獲得Bt菌株。

1.2.2 菌體的液體培養(yǎng)

液體種子培養(yǎng)基的組成如下:胰蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%,酵母膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%,葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%,磷酸氫二鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08%,去離子水500 mL。滅菌前用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0。將固體培養(yǎng)基所得到的Bt菌株用無(wú)菌水制成一級(jí)種子,接種到液體種子培養(yǎng)基中,在恒溫光照培養(yǎng)箱中以250 r/min的轉(zhuǎn)速于30℃培養(yǎng)16 h,獲得Bt發(fā)酵液。

1.2.3 晶體的提純與分離

將培養(yǎng)成熟的Bt發(fā)酵液用磁力攪拌器攪拌。孢子的密度較小,大部分進(jìn)入泡沫,而蛋白晶體處于水層。除去泡沫,使孢子和晶體得到初步分離,再經(jīng)多次重復(fù)以盡量除去孢子。然后用超聲波處理,使芽孢、晶體以及碎片在水中均勻分散。在4℃冰箱內(nèi)放置24 h,使芽孢和伴孢晶體充分游離。于7 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min,棄去上層清液。加蒸餾水制成懸浮液,離心洗滌3次,然后用0.5 mol/L的NaCl溶液洗滌2次,收集沉淀物。將得到的沉淀物用生理鹽水制成孢晶懸液,放入4℃冰箱備用,每次制成水懸液都經(jīng)超聲波處理。

將孢晶懸液離心分離,使沉淀懸浮于0.4 mol/L的NaCl+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的 Triton X-100(二者體積比為1︰1)的溶液中,在4℃的冰箱里靜置過(guò)夜。離心分離,收集沉淀物,制成水懸液。配制濃度不同(2.8,3.2,3.6 mol/L)的溴化鈉溶液,將水懸液放在溴化鈉溶液中,于7 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心分離15 min即在2.8 mol/L和3.6 mol/L的界面處得到伴孢晶體層,用彎頭注射器沿壁插入,收集含有晶體的溴化鈉溶液。將得到的溴化鈉溶液于7 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心分離10 min,收集晶體沉淀,用蒸餾水洗滌沉淀3～4次,配制成晶體水懸液,并置入冰箱冷凍過(guò)夜后,放入冷凍干燥機(jī)中干燥,得到白色的晶體蛋白。用此方法獲得的晶體純度可達(dá)99%以上,產(chǎn)率為28%。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波條件的選擇

為了將Bt的孢子囊和伴孢晶體分離開(kāi),通常使用的手段是進(jìn)行超聲波處理,文獻(xiàn)中介紹的一般方法是間隔時(shí)間為0.1 s,超聲時(shí)間為1 s,超聲次數(shù)為50次,目測(cè)分離效果。超聲時(shí)間過(guò)短,分離效果差;超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng),容易破壞伴孢晶體。為了更準(zhǔn)確選定超聲條件,使用顯微鏡代替人眼進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)在上述條件下仍有部分孢子囊和伴孢晶體沒(méi)有分開(kāi),超聲強(qiáng)度還有加大的空間。因此,調(diào)整了超聲條件,使用顯微鏡進(jìn)行觀察,既保證孢子囊和伴孢晶體的良好分離,又不破壞伴孢晶體。最終選定的優(yōu)化條件如下:間隔時(shí)間為0.1 s,超聲時(shí)間為2 s,超聲次數(shù)為90次。

2.2 水懸液制備方法的改進(jìn)

在洗滌過(guò)程中,傳統(tǒng)方法是在離心后將溶液直接制成水懸液,不能使晶體蛋白分散均勻。本實(shí)驗(yàn)采用增加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的 Triton X-100的用量,加超聲波處理(處理?xiàng)l件:間隔時(shí)間為0.1 s,超聲時(shí)間為1 s,超聲次數(shù)為20次),使晶體蛋白在懸浮劑中均勻分散。傳統(tǒng)的液體雙相分離法純度不夠,本實(shí)驗(yàn)在液體雙相分離前對(duì)水懸液作進(jìn)一步處理,在很大程度上提高了晶體蛋白的純度和產(chǎn)率。

2.3 紫外線輻射條件的改進(jìn)

傳統(tǒng)方法中,經(jīng)常使用紫外線來(lái)處理半成品以避免細(xì)菌滋生,但是紫外線具有破壞伴孢晶體的特性。為了證實(shí)這一點(diǎn)進(jìn)行了對(duì)照實(shí)驗(yàn),用小菜蛾測(cè)定伴孢晶體的活性。研究發(fā)現(xiàn),輻射10 min,毒力效價(jià)從80 000 IU/mg降到了30 000 IU/mg,這說(shuō)明用紫外線照射半成品會(huì)嚴(yán)重降低伴孢晶體的活性。因此,不用紫外線輻射來(lái)殺菌,而采用在無(wú)菌操作臺(tái)操作,收到了很好的效果。

2.4 分離晶體的純度鑒定

本實(shí)驗(yàn)采用涂片鏡檢,采用革蘭氏染色法計(jì)算出晶體的純度。對(duì)提純后的晶體進(jìn)行染色鏡檢,選擇10個(gè)視野,計(jì)算平均值。采用此方法求得產(chǎn)品的純度在90%以上。同時(shí)采用電子掃描電鏡進(jìn)行觀察,放大6 000倍在電鏡下可清晰地觀察到菱形或矩形的伴孢晶體。

2.5 產(chǎn)品毒力效價(jià)的測(cè)定

伴孢晶體的毒力效價(jià)是衡量其活性的一個(gè)重要指標(biāo),采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)浸液飼喂法進(jìn)行毒力測(cè)定,用已配制好的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品和產(chǎn)品懸浮液浸泡定量的蓮花白菜葉。供饑餓24 h的三齡初小菜蛾飼食,48 h后檢查小菜蛾的死亡情況,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 產(chǎn)品毒力效價(jià)的測(cè)定結(jié)果Tab.1 Testing result on toxicity efficiency of product

將測(cè)定質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)值,將校正死亡率轉(zhuǎn)換成死亡幾率值,進(jìn)行直線擬合,得到標(biāo)準(zhǔn)品和產(chǎn)品的回歸方程、半數(shù)致死量L C50值及其毒力效價(jià)。標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程為y=3.231 7+1.362 1x,相關(guān)系數(shù)為0.919,半數(shù)致死量為19.871 mg/L。樣品的回歸方程為y=5.300 6+1.569 6x,相關(guān)系數(shù)為0.960,半數(shù)致死量為0.643 mg/L。由此求得樣品的毒力效價(jià)為556 264.4 IU/mg。由表1可以得出,樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的回歸相關(guān)系數(shù)均不低于0.919,說(shuō)明稀釋質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值與死亡幾率值呈現(xiàn)高度相關(guān),制劑質(zhì)量濃度與測(cè)定昆蟲(chóng)死亡關(guān)系密切,測(cè)定結(jié)果比較可靠有效,產(chǎn)率從原來(lái)的 20%提高到了28%。同時(shí),校正死亡率及幾率值隨質(zhì)量濃度的降低而遞減,能夠達(dá)到檢測(cè)要求。從測(cè)定的結(jié)果看,此方法分離所得到產(chǎn)品的毒力效價(jià)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)方法得到產(chǎn)品的毒力效價(jià)。

3 結(jié) 語(yǔ)

1)通過(guò)顯微鏡觀察深入研究了超聲波分離伴孢晶體的條件,認(rèn)為間隔時(shí)間為0.1 s,超聲時(shí)間為2 s,超聲次數(shù)為90次是比較優(yōu)化的條件。

2)通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)佐證,認(rèn)為對(duì)半成品進(jìn)行紫外線輻射滅菌將嚴(yán)重影響產(chǎn)品的活性,提出采用無(wú)菌操作臺(tái)來(lái)完成操作,省去了紫外線輻射步驟,使產(chǎn)品活性大大提高。

3)改進(jìn)了懸浮液溶劑,提高了蛋白的分散均勻性。產(chǎn)品經(jīng)染色鏡檢純度在90%以上,電鏡觀察晶型良好,毒力效價(jià)測(cè)試為556 264.4 IU/mg,產(chǎn)率從原來(lái)的20%提高到了28%。本方法成本低,產(chǎn)率高,操作簡(jiǎn)單,應(yīng)用前景廣闊。

[1]趙新民,黃 凡,付祖姣,等.殺線蟲(chóng)蘇云金芽孢桿菌研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥,2007,46(5):296-299.

[2]劉金環(huán),薛 靜,宋富平.蘇云金芽孢桿菌BtC008殺蟲(chóng)晶體蛋白基因鑒定、克隆及殺蟲(chóng)活性分析[J].植物保護(hù),2006,32(6):22-26.

[3]李海濤,王洪成,劉志洋.Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白的研究概述[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(5):37-39.

Isolation and purification of protein crystal from Bt

YANG Kai-jie
(Polytechnic Department,Xingtai University of Broadcast and Television,Xingtai Hebei 054000,China)

There are many methods such as liquid double phase,density gradient,sediment,bio-physics separation and so on,frequently used to isolate and purify the protein crystal from bacillus thuringiensis(Bt).However,these methods have their own defects as well as advantages.In this paper,the isolation cost,the equipment,the purity,the output and the activity were considered.Three improvements on ultrasonic wave process,suspension liquid preparation and ultraviolet ray radiation were made.Thus,a new method to separate crystal protein from Bt was set up.This technology has a characteristic of low cost,simple operation and high application.The production ratio is improved from 20%to 28%with the product purity of 90%.

bacillus thuringiensis(Bt);isolation and purification;protein crystal

Q939

A

1008-1534(2011)04-0254-03

2010-07-07;

2011-03-29

責(zé)任編輯:張士瑩

楊開(kāi)杰(1964-),男,河北邢臺(tái)人,講師,主要從事生物農(nóng)藥方面的研究。