種間對(duì)比研究方法闡明解耦聯(lián)蛋白與最大壽命的關(guān)系

王春明 鄭榮梁 (蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物物理研究所,甘肅 蘭州 730000)

活性氧作為氧自由基及其衍生物是體內(nèi)最常見的自由基類物質(zhì),發(fā)揮著重要的生物作用。體內(nèi)生成活性氧的源頭是線粒體,線粒體活性氧產(chǎn)率與動(dòng)物最大壽命負(fù)相關(guān),線粒體解耦聯(lián)蛋白 (uncoupling protein,UCP)能降低線粒體活性氧產(chǎn)率。因此,UCP很可能具有延緩衰老的作用,且可能是壽命的決定性因素。目前,探索 UCP與壽命關(guān)系的研究雖然很多,但結(jié)果相互矛盾。因此,本文擬提出應(yīng)用種間對(duì)比研究方法闡明這一問題。

1 線粒體活性氧產(chǎn)率與動(dòng)物最大壽命負(fù)相關(guān)

對(duì)比研究為衰老的自由基理論提供了重要證據(jù),線粒體活性氧產(chǎn)率與最大壽命負(fù)相關(guān)的研究主要有：①5種蠅胸飛行肌線粒體活性氧產(chǎn)率與其壽命負(fù)相關(guān)〔1〕;②哺乳動(dòng)物肝、腎和心肌線粒體活性氧產(chǎn)率與其最大壽命負(fù)相關(guān)〔2,3〕;③鳥類壽命遠(yuǎn)高于鼠,其線粒體活性氧產(chǎn)率遠(yuǎn)低于鼠〔4,5〕;④親緣關(guān)系較近的兩種小鼠M.m usculus和 P.leucopus,者壽命僅是后者的一半,短壽鼠線粒體超氧陰離子自由基 (O2)和 H2O2產(chǎn)率分別比高壽鼠多 48%～74%和 300%～500%〔6〕。

對(duì)比研究還解決了衰老的代謝率理論所不能解釋的矛盾現(xiàn)象。衰老的代謝率理論一直在衰老研究領(lǐng)域占有重要地位,認(rèn)為壽命與代謝率呈負(fù)相關(guān)。但有些動(dòng)物壽命不符合這個(gè)學(xué)說。比如小鼠M.m usculus的代謝率低于 P.leucopus,但是前者壽命反而小于后者〔6〕;鳥類和靈長(zhǎng)類的壽命都遠(yuǎn)高于依據(jù)其代謝率推斷的預(yù)期值〔7〕。例如：鴿的代謝率為 465 L O2/g,遠(yuǎn)高于大鼠 28 L O2/g,但鴿的壽命 (35年)卻遠(yuǎn)長(zhǎng)于大鼠 (4年)〔8〕。而衰老的自由基理論根據(jù)線粒體自由基產(chǎn)率這個(gè)指標(biāo)完滿地解釋了上述現(xiàn)象。對(duì)比研究發(fā)現(xiàn),若用單位耗氧量生成自由基及其衍生物的量來衡量(常以線粒體產(chǎn)生 H2O2作為廣義的自由基的代表),消耗同樣多的氧,鴿線粒體產(chǎn)生的 H2O2僅為大鼠的 1/10,這正好對(duì)應(yīng)了鴿的壽命約為大鼠壽命 10倍的現(xiàn)象〔4〕。可見,不論種內(nèi),還是種間對(duì)比研究,都表明線粒體自由基產(chǎn)率與壽命負(fù)相關(guān)。Barja曾對(duì)這類對(duì)比研究的結(jié)果有過比較系統(tǒng)的總結(jié)〔9〕。莫斯科國(guó)立大學(xué)的 Skulachev教授曾于 2004年在 Aging Cell雜志發(fā)表文章,專門討論了 Barja等人的鳥鼠對(duì)比研究成果〔10〕。

但是,同樣是線粒體,為什么它們的活性氧產(chǎn)率如此不同呢?針對(duì)這一問題,Lass等曾報(bào)道 9種哺乳動(dòng)物 (小鼠、大鼠、豚鼠、兔、豬、山羊、綿羊、牛和馬)心肌線粒體生成 O·-2的量與其所含輔酶 Q(CoQ)同族體 CoQ9含量正相關(guān),與 CoQ10量負(fù)相關(guān),但是他們同時(shí)卻發(fā)現(xiàn)并不能把不同哺乳動(dòng)物線粒體 O·-2產(chǎn)量的差異歸因于 CoQ9和 CoQ10量的不同〔11〕;后續(xù)研究還發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充 CoQ10也并不能增強(qiáng)動(dòng)物抗氧化能力及延長(zhǎng)壽命〔12〕。因此,CoQ是否能合理地解決前述問題尚需更多證據(jù)。可見,自由基理論在線粒體及其產(chǎn)生的活性氧水平上似乎完滿地解釋了決定衰老和壽命的根本原因,然而其更深層次的機(jī)制,即到底是什么決定了線粒體在活性氧產(chǎn)率方面存在如此大的差異,卻依然有待深入探索。近年來,新的線粒體內(nèi)膜 UCP同源蛋白的發(fā)現(xiàn)讓人們看到了解決這一問題的曙光。

2 UCP降低線粒體自由基產(chǎn)率

UCP是一類位于線粒體內(nèi)膜的跨膜蛋白。哺乳動(dòng)物共含有 5種同源蛋白,它們是 UCP1～UCP5〔13,14〕。這 5種 UCP在動(dòng)物體內(nèi)的分布和表達(dá)具有組織特異性。UCP1存在于褐色脂肪組織;UCP2的分布最為廣泛,其 mRNA表達(dá)水平在不同器官中差異較大,例如脾臟中 UCP2表達(dá)很高,而肝臟中較低;UCP3主要存在于骨骼肌和心肌中;UCP4和 UCP5主要在大腦中〔13～16〕。近年來 ,在線蟲、果蠅、魚類、鳥類、爬行類甚至植物中也相繼發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物 UCP的同源蛋白〔13,14,17,18〕。

UCP1在褐色脂肪組織中負(fù)責(zé)非寒戰(zhàn)性產(chǎn)熱,對(duì)冬眠動(dòng)物和新生兒體溫維持起重要作用〔15,16〕。其他 4種 UCP,盡管它們的基因序列與 UCP1相比同源性很高,同屬于 UCP家族,但其生理功能尚無定論。它們都具有使呼吸鏈質(zhì)子回流,使氧化磷酸化輕微解耦聯(lián),進(jìn)而降低線粒體自由基生成的作用。UCP的這一功能恰恰受到了自由基的激活〔19〕,即 UCP對(duì)線粒體自由基的生成具有反饋性抑制作用。2008年,Nature雜志報(bào)道胃內(nèi)產(chǎn)生的生長(zhǎng)素釋放肽 ghrelin對(duì)神經(jīng)元發(fā)揮作用的機(jī)制就在于UCP2降低了自由基的產(chǎn)生〔20〕。2009年 Jiang等發(fā)現(xiàn) UCP在運(yùn)動(dòng)過程中表達(dá)升高,可能起到保護(hù)運(yùn)動(dòng)造成的氧化脅迫對(duì)線粒體的損傷作用〔21〕。

UCP降低線粒體自由基產(chǎn)率的工作原理見圖1：呼吸鏈的電子傳遞在線粒體內(nèi)膜兩側(cè)建立了跨膜質(zhì)子梯度 (trans-membrane proton gradient,△pH)和線粒體膜電位 (mitochondrial membrane potential,△Ψm),△pH和 △Ψm的升高,促進(jìn)了 O·-2的生成;而 UCP可以把質(zhì)子從膜間隙流入基質(zhì),從而使△pH和△Ψm降低,使氧化磷酸化輕微解耦聯(lián),降低自由基的生成。也可以這樣形象地理解：UCP是一個(gè)巧妙的設(shè)計(jì),它就像大自然安裝在線粒體內(nèi)膜的安全閥一樣,當(dāng)線粒體產(chǎn)生過多自由基而具有危害時(shí),UCP就被激活而降低自由基的生成,從而減少氧化性損傷。

圖1 解耦聯(lián)蛋白降低線粒體自由基生成示意圖

3 UCP與壽命關(guān)系研究的現(xiàn)狀和困境

線粒體是正常生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)自由基的主要來源,由它產(chǎn)生的自由基對(duì)細(xì)胞損傷的積累導(dǎo)致了衰老,并影響壽命的長(zhǎng)短〔22〕。UCP既然從源頭上調(diào)控著自由基的產(chǎn)生,其對(duì)衰老和壽命的影響就是本質(zhì)性的。從這個(gè)意義上來說,UCP可能是決定壽命的原初分子。

UCP與壽命關(guān)系的研究才剛剛起步〔23,24〕。2005年,Fridell等報(bào)道把人UCP2基因轉(zhuǎn)入果蠅的神經(jīng)系統(tǒng)后,果蠅壽命延長(zhǎng)了 10%～30%〔25〕;他們隨后把果蠅體內(nèi) DmUCP5基因敲除后,在食用低熱量食物情況下,比野生型果蠅的壽命還要長(zhǎng),而在食用高熱量食物時(shí)則無差別〔26〕。前一個(gè)研究發(fā)現(xiàn) UCP有利于壽命的延長(zhǎng),但是第二個(gè)研究卻發(fā)現(xiàn) UCP基因的敲除卻并沒有使果蠅壽命縮短。這表明敲除果蠅整體的 DmUCP5基因?qū)墘勖挠绊懕戎辉谏窠?jīng)系統(tǒng)中過表達(dá) UCP2基因更復(fù)雜。更有甚者,Humphrey等 2009年報(bào)道把人 UCP3基因 (hUCP3)分別轉(zhuǎn)入果蠅整體、泛神經(jīng)元以及神經(jīng)分泌細(xì)胞〔27〕。結(jié)果發(fā)現(xiàn),果蠅整體低表達(dá) hUCP3對(duì)線粒體的質(zhì)子內(nèi)流無影響,在泛神經(jīng)元中高表達(dá) hUCP3則增加了質(zhì)子內(nèi)流,在神經(jīng)元內(nèi)的中度表達(dá)可使雄性果蠅壽命稍微延長(zhǎng),但是在神經(jīng)組織中的高表達(dá)卻造成果蠅壽命的縮短。分析發(fā)現(xiàn),人為的基因表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因果蠅造成的影響是多方面的,神經(jīng)組織高表達(dá) hUCP3的結(jié)果造成了胰島素樣多肽水平的升高,這可能與壽命的縮短相關(guān)聯(lián)。這一研究結(jié)果也告誡人們,試圖應(yīng)用基因操作方法通過高表達(dá)UCP在增大質(zhì)子內(nèi)流的同時(shí),造成的影響可能會(huì)是多方面的,不一定會(huì)得到延長(zhǎng)壽命的預(yù)期結(jié)果。因此,在研究 UCP與壽命的關(guān)系時(shí),基因操作的方法并不適用。線蟲實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),敲除 CeUCP-4基因后并沒有影響到線蟲的抗氧化能力和壽命〔28〕。這個(gè)結(jié)果似乎也不支持 UCP與壽命之間存在聯(lián)系。但是,2009年 Lemire等人用線粒體解耦聯(lián)劑氰氯苯腙 (CCCP)卻證實(shí)線粒體的解耦聯(lián)作用可以延長(zhǎng)線蟲的壽命〔29〕。因此,前述 CeUCP-4基因敲除不影響線蟲壽命的報(bào)道很可能是基因敲除方法影響了線蟲其他基因表達(dá)而造成的。這也進(jìn)一步證明了基因操作方法在UCP與壽命關(guān)系研究中的局限性。2006年12月第一篇應(yīng)用基因操作手段研究 UCP與哺乳動(dòng)物壽命的文獻(xiàn)發(fā)表在 Science上〔30〕,作者用轉(zhuǎn)基因的方法使小鼠下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞過表達(dá) UCP2,導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因鼠體溫下降,最終延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的壽命。這一工作為UCP2能夠調(diào)控高等生物體壽命提供了直接證據(jù)。2009年Andrews等詳細(xì)報(bào)道了UCP2調(diào)控小鼠壽命的現(xiàn)象〔31〕。他們發(fā)現(xiàn),UCP2的缺失使野生型小鼠壽命縮短,而且 UCP2表達(dá)水平與線粒體特有的超氧化物歧化酶(SOD-2)突變小鼠的存活率正相關(guān)。因此認(rèn)為 UCP2有助于壽命的延長(zhǎng),進(jìn)一步證實(shí)了小鼠 UCP2對(duì)其壽命的重要作用。特別值得一提的是,他們同時(shí)報(bào)道了大鼠不同組織的線粒體解耦聯(lián)能力強(qiáng)于小鼠的現(xiàn)象,似乎預(yù)示了大鼠壽命高于小鼠。這說明同行中已經(jīng)有人注意到了對(duì)比研究方法在 UCP與壽命關(guān)系研究中的潛在作用。

以上實(shí)驗(yàn)在肯定UCP2延長(zhǎng)壽命作用的同時(shí),也反映出所用實(shí)驗(yàn)方法存在的缺陷。在所用的 3類動(dòng)物模型 (果蠅、線蟲、小鼠)中,果蠅和小鼠特定神經(jīng)元過表達(dá) UCP可延長(zhǎng)壽命〔25,30〕,但果蠅整體過表達(dá)或某些組織過表達(dá) UCP的結(jié)果卻很復(fù)雜〔27〕,而果蠅和線蟲中敲除內(nèi)源 UCP基因卻不影響壽命〔26,28〕。這一方面說明 UCP過表達(dá)的效果具有組織特異性,也說明 UCP敲除的影響有可能被其他機(jī)制所補(bǔ)償,比如,UCP缺失造成的對(duì)活性氧調(diào)節(jié)功能的損害,可通過其他抗氧化機(jī)制得到補(bǔ)償;還有可能是基因操作方法本身影響到了其他基因的功能,最終掩蓋了 UCP基因敲除對(duì)壽命的影響。不僅如此,基因操作方法在研究哺乳動(dòng)物壽命方面存在難以彌補(bǔ)的缺陷。例如,小鼠壽命較短,用基因操作的方法來研究尚需幾年時(shí)間,對(duì)于更長(zhǎng)壽命的哺乳動(dòng)物用基因操作的方法研究壽命就更難了。因此,種間對(duì)比研究在不干擾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳背景的前提下,更適合闡明哺乳動(dòng)物UCP與壽命的關(guān)系。

4 種間對(duì)比研究方法應(yīng)用于UCP與壽命關(guān)系研究

種間對(duì)比研究已經(jīng)揭示了線粒體活性氧產(chǎn)率與最大壽命負(fù)相關(guān)的規(guī)律,推測(cè) UCP與壽命有關(guān)的觀點(diǎn)也正是基于這一規(guī)律。我們通過對(duì)金絲雀和小鼠心肌線粒體的對(duì)比研究,發(fā)現(xiàn)前者 UCP活性及蛋白表達(dá)水平分別是后者的 3倍和 4倍,基本與金絲雀心肌線粒體自由基產(chǎn)率低的現(xiàn)象相一致〔32〕。這一結(jié)果對(duì)于種間對(duì)比研究方法應(yīng)用于 UCP與壽命關(guān)系研究提供了很好的支持。

總之,衰老是一個(gè)長(zhǎng)期復(fù)雜的過程,是受多因素影響和決定的。對(duì)UCP功能的深入研究有利于揭開衰老和壽命的部分奧秘。

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