復(fù)合誘變選育乳鏈菌肽高產(chǎn)菌株

李海娜，蘇移山，張曉元，朱希強(qiáng)，臧恒昌，郭學(xué)平

(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2.山東省生物藥物研究院，山東 濟(jì)南 250101)

復(fù)合誘變選育乳鏈菌肽高產(chǎn)菌株

李海娜1，2，蘇移山2，張曉元2，朱希強(qiáng)1，2，臧恒昌1，郭學(xué)平1，2

(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2.山東省生物藥物研究院，山東 濟(jì)南 250101)

目的 選育乳鏈菌肽高產(chǎn)菌株。方法 以乳酸鏈球菌ATCC11454為出發(fā)菌株，采用紫外線、微波和亞硝酸鈉對(duì)其進(jìn)行復(fù)合誘變處理，并結(jié)合乳鏈菌肽抗性篩選選育出高產(chǎn)乳鏈菌肽的菌株。結(jié)果 通過(guò)選育獲得一株乳鏈菌肽的高產(chǎn)菌株Nis-123，乳鏈菌肽產(chǎn)量為5 250 U/mL，較出發(fā)菌株提高了4.3倍。傳代實(shí)驗(yàn)證明該菌株遺傳性穩(wěn)定。結(jié)論 紫外線、微波和亞硝酸鈉復(fù)合誘變結(jié)合乳鏈菌肽抗性選育可以提高乳酸鏈球菌的產(chǎn)肽能力。

復(fù)合誘變;乳鏈菌肽;選育

乳鏈菌肽(nisin)，又稱乳酸鏈球菌肽(素)，是乳酸鏈球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)產(chǎn)生的一種多肽，對(duì)多種革蘭陽(yáng)性菌，包括對(duì)食品造成嚴(yán)重危害的許多腐敗菌有強(qiáng)烈的抑制作用，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)與世界衛(wèi)生組織(WHO)批準(zhǔn)使用的食品防腐劑。近年來(lái)，隨著高純度nisin的研制及與螯合劑的聯(lián)合使用，其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛［1］。nisin可明顯抑制對(duì)多種藥物都具有耐藥性的肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌等病原菌，有可能解決此類耐藥性問(wèn)題。此外，nisin作為藥物治療胃潰瘍?nèi)〉昧孙@著療效，使其生物合成倍受關(guān)注［2-3］。自然界中分離得到的nisin生產(chǎn)菌株生物合成nisin的量一般較低，達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，必須通過(guò)菌株改良，提高nisin的產(chǎn)量。復(fù)合誘變是普遍采用的提高微生物生產(chǎn)性能的主要方法，通常是指兩種或多種誘變劑先后或同時(shí)作用于微生物，或同一種誘變劑重復(fù)作用于微生物。普遍認(rèn)為，復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng)，如果誘變劑合理搭配使用，復(fù)合誘變較單一誘變效果好。同時(shí)，根據(jù)乳酸鏈球菌中nisin產(chǎn)生(nip+)、nisin抗性(nisr)以及調(diào)控基因緊密連鎖而容易發(fā)生共突變的理論［4］，利用nisin抗性突變作為篩選標(biāo)記，可以進(jìn)行nisin高產(chǎn)菌株的定向選育。姜麗艷等［5］已采用硫酸二乙酯誘變結(jié)合nisin抗性篩選得到一株nisin高產(chǎn)菌株，證明該定向選育的方法有較好的篩選效果。本研究采用紫外線、微波和亞硝酸鈉對(duì)菌株進(jìn)行復(fù)合誘變，篩選高產(chǎn)nisin的菌株。

1 材料

1.1 菌種

出發(fā)菌株:乳酸鏈球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)ATCC11454，購(gòu)于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所;檢測(cè)菌株:藤黃微球菌(Micrococcus luteus)NCIB 8166，購(gòu)于山東省藥品檢驗(yàn)所。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:M17培養(yǎng)基中加0.5%葡萄糖，115℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖30 g/L，牛肉膏30 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO410 g/L，NaCl 2 g/L，pH值為6.8，121℃滅菌20 min，固體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉20 g/L。

檢測(cè)菌培養(yǎng)基:蛋白胨8 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖 5 g/L，Na2HPO4·12H2O 5 g/L，NaCl 5 g/L，吐溫20 10 mL/L，瓊脂粉 8 g/L，pH 值為 7.2 ～7.4，115℃滅菌20 min。

1.3 nisin 標(biāo)準(zhǔn)品

Sigma N5764，比活 1 000 U/mg。

2 方法

2.1 紫外線誘變

出發(fā)菌株單菌落接種于裝有種子培養(yǎng)基50 mL的250 mL錐形瓶中，30℃，100 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期;6 000 r/min離心5 min，棄上清液，所得菌體用生理鹽水懸浮，調(diào)整菌體濃度為108cfu/mL。將菌懸液3 mL和磁力攪拌棒放入直徑為75 cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，置于30 W紫外燈下，垂直距離30 cm照射。處理后的菌懸液涂于抗性平板(固體培養(yǎng)基中加入一定量的nisin標(biāo)準(zhǔn)品)，30℃倒置培養(yǎng)。

菌懸液分別用紫外線處理 0，10，15，20，25，30，40，50 s后，在紅光下稀釋不同梯度涂板，30℃培養(yǎng)30 h，計(jì)算致死率。致死率=(未經(jīng)誘變的平板菌落數(shù)－誘變后的再生菌落數(shù))/未經(jīng)誘變的平板菌落數(shù)×100%。

2.2 微波誘變

將紫外線誘變得到的高產(chǎn)菌株單菌落接種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，直接放入微波爐中以高強(qiáng)度微波(850 W)處理，每隔10 s取出冷卻以消除熱效應(yīng)。處理后的菌液涂于抗性平板，30℃倒置培養(yǎng)。

菌懸液分別用微波高火處理 0，10，20，30，40，50 s后，稀釋至不同梯度涂板，30℃的條件下培養(yǎng)30 h，計(jì)算致死率。

2.3 亞硝酸鈉誘變

將微波誘變得到的高產(chǎn)菌株單菌落接種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，離心，棄去上清液，所得菌體用0.1 mol/L，pH 4.6的醋酸緩沖液洗滌并懸浮，調(diào)整菌體濃度為 108cfu/mL。將菌懸液、醋酸緩沖液和1 mol/L NaNO2溶液(1∶1∶1)加入到已滅菌的密閉離心管中，30℃水浴處理。誘變結(jié)束后立即用0.07 mol/L磷酸氫二鈉溶液(pH 8.6)8 mL終止反應(yīng)。處理后的菌液涂于抗性平板，30℃倒置培養(yǎng)。

菌懸液分別用亞硝酸鈉溶液處理0，10，20，30，40，50 min，取樣稀釋涂平板，30℃的條件下培養(yǎng)30 h，計(jì)算致死率。

2.4 抗性平板中nisin濃度的確定

將培養(yǎng)好的菌懸液涂布在含有不同濃度nisin的抗性培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)，觀察菌體的生長(zhǎng)情況，確定合適濃度的抗性平板。

2.5 高產(chǎn)菌株的篩選

采用雙層平板法，平板下層倒入含有檢測(cè)菌的檢測(cè)培養(yǎng)基15 mL，水平放置，待凝固后再倒入平板分離培養(yǎng)基(同液體發(fā)酵培養(yǎng)基，加1.2%的瓊脂)5 mL，涂布一定稀釋度的處理菌液后，30℃培養(yǎng)24 h，菌落周圍出現(xiàn)透明的抑菌圈，挑取抑菌圈較大的菌落進(jìn)行復(fù)篩。

初篩菌株逐個(gè)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，100 r/min振蕩培養(yǎng)30 h，測(cè)定發(fā)酵液中nisin效價(jià)。經(jīng)反復(fù)篩選，選出nisin效價(jià)較高的突變菌株。

2.6 發(fā)酵液nisin效價(jià)的測(cè)定方法

用0.02 mol/L鹽酸將發(fā)酵液稀釋到其抑菌圈直徑在5～100 U/mL的nisin標(biāo)準(zhǔn)液的抑菌圈直徑之間(效價(jià)在5～100 U/mL時(shí)，效價(jià)對(duì)數(shù)值與抑菌直徑存在直線關(guān)系)，沸水浴加熱3 min，9 000 r/min離心3 min，取上清液與nisin標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入檢測(cè)平板的各個(gè)孔洞內(nèi)，30℃培養(yǎng)20 h左右，測(cè)定抑菌圈直徑，并由此算出發(fā)酵液的效價(jià)。

2.7 菌株穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

篩選得到的菌株接入斜面培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h后作為F1代，從F1代斜面轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h后作為F2代，同樣方式連續(xù)傳代20次。每培養(yǎng)3代取斜面，接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 h后測(cè)定的抑菌圈大小，考察其抑菌活性的傳代穩(wěn)定性。

3 結(jié)果

3.1 抗性平板中nisin濃度確定結(jié)果

經(jīng)驗(yàn)證出發(fā)菌株nisin抗性為2 000 U/mL。在誘變過(guò)程當(dāng)中，由于共突變的發(fā)生，菌株對(duì)nisin的抗性也產(chǎn)生正突變而逐步有所提高。在反復(fù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，紫外誘變抗性平板中nisin的最大抑制濃度為9 000 U/mL，微波誘變中最大抑制濃度為15 000 U/mL，亞硝酸鈉最大抑制濃度為18 000 U/mL。

3.2 紫外線誘變致死率的測(cè)定

結(jié)果見圖1A。20，25，30和50 s時(shí)的致死率分別為 73.0%，82.2%，93.1% 和 100%。據(jù)報(bào)道［6］，70%～80%為紫外線誘變育種的最適致死率，因此將20 s作為紫外重復(fù)誘變的處理時(shí)間。

圖1 乳酸鏈球菌紫外誘變(A)、微波誘變(B)和亞硝酸鈉誘變(C)致死率Fig.1 Effect of ultraviolet(A)，microwave(B)and sodium nitrite(C)on cell mortality

3.3 紫外線誘變選育的結(jié)果

在含nisin 9 000 U/mL的抗性平板中得到4株產(chǎn)量較高的突變菌，并選擇產(chǎn)量最高的UV-8進(jìn)行下一輪的微波誘變。結(jié)果見表1。

表1 紫外線誘變選育結(jié)果Tab.1 Results of screening by UV treatment

3.4 微波誘變致死率的測(cè)定

結(jié)果見圖1B。40，50，60和70 s時(shí)致死率分別為74.4%，85.6%，95.0% 和 100%，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［7］，微波誘變的處理時(shí)間控制在50 s。

3.5 微波誘變選育的結(jié)果

在nisin含量為15 000 U/mL的抗性平板中選取到2株產(chǎn)量較高的突變菌，結(jié)果見表2。

表2 微波誘變選育結(jié)果Tab.2 Results of screening by MW treatment

3.6 亞硝酸鈉誘變致死率的測(cè)定

選擇MW-109進(jìn)行亞硝酸鈉誘變，結(jié)果見圖1C。40，50，60 和70 min 時(shí)，致死率分別為 68.5%，82.2%，96.3%和 100%。據(jù)報(bào)道［8］，亞硝酸鈉誘變致死率在80%左右正突變率最高，因此將50 min作為亞硝酸鈉重復(fù)誘變的誘變時(shí)間。

3.7 亞硝酸鈉誘變選育的結(jié)果

在nisin含量為18 000 U/mL的抗性平板中得到3株產(chǎn)量較高的突變菌，其中菌株Nis-123產(chǎn)量最高，效價(jià)已達(dá)5 250 U/mL。結(jié)果見表3。

表3 亞硝酸鈉誘變選育結(jié)果Tab.3 Results of screening by NaNO2 treatment

3.8 菌種穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選擇產(chǎn)量最高的菌株Nis-123進(jìn)行菌種穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4，突變株Nis-123產(chǎn)量穩(wěn)定，未發(fā)生明顯的回復(fù)突變。

表4 nisin高產(chǎn)菌株Nis-123穩(wěn)定性考察結(jié)果Tab.4 Experimental results of nisin-producing stability by Nis-123

4 討論

以乳酸鏈球菌素ATCC11454為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線、微波、亞硝酸鈉誘變，nisin抗性篩選的定向選育方法得到的高產(chǎn)菌株Nis-123，產(chǎn)nisin效價(jià)達(dá)到5 250 U/mL，比出發(fā)菌株提高了4.3倍，傳代實(shí)驗(yàn)證明其穩(wěn)定性較好，達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

Nisin高產(chǎn)菌株的獲得主要是傳統(tǒng)的隨機(jī)誘變育種，該方法具有周期長(zhǎng)，工作量大的缺點(diǎn)，得到的高產(chǎn)菌株雖產(chǎn)量有所提高，但滿足工業(yè)生產(chǎn)要求的不多。推理選育在對(duì)產(chǎn)物合成途徑有一定了解的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)最優(yōu)的篩選方案，縮短篩選時(shí)間，提高工作效率。本實(shí)驗(yàn)采用nisin抗性篩選的推理選育方法，快速、有效，值得進(jìn)一步推廣。

紫外誘變是一種物理誘變因子，具有誘變效果明顯和方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是誘變選育的一種主要方法，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的非常普遍。但采用紫外線和其他誘變因子進(jìn)行復(fù)合誘變，往往會(huì)取得更理想的誘變效果。本實(shí)驗(yàn)采用紫外、微波及亞硝酸鈉復(fù)合誘變選育得到的高產(chǎn)菌株，其效果明顯優(yōu)于單因子誘變。隨著對(duì)nisin的生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)理論的認(rèn)識(shí)的加深，利用基因工程技術(shù)對(duì)nisin生產(chǎn)菌進(jìn)行改良，獲得nisin高產(chǎn)菌株也將是nisin研究、開發(fā)的重點(diǎn)。

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Breeding of high-yield strain of nisin by compound mutation

LI Hai-na1，2，SU Yi-shan2，ZHANG Xiao-yuan2，ZHU Xi-qiang1，2，ZANG Heng-chang1，GUO Xue-ping1，2
(1.School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China;2.Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province，Jinan 250101，China)

Purpose To screen a high-yield strain of nisin.Methods With Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC11454 as the starting strain，the mutant with high-yield nisin was bred after ATCC11454 was treated by the compound mutation of ultraviolet，microwave and sodium nitrite and the resistance screening.Results The nisin yield of the selected strain Nis-123 was 5 250 U/mL，increasing by 4.3 times compared with the starting strain.The passages showed that the heredity character of the mutant strain was stable.Conclusion The yield of nisin can be elevated through the compound mutation of ultraviolet，microwave，sodium nitrite and the resistance screening.

compound mutation;nisin;breeding

TQ465.92

A

1005-1678(2011)05-0378-04

2010-04-20

李海娜，女，碩士研究生，制藥工程專業(yè);郭學(xué)平，通信作者，研究員，碩士生導(dǎo)師，Tel:0531-82685555，E-mail:guo-xp@139.com。