離子交換-反相色譜純化育亨賓

陶 蕾，趙明珠，趙鳳生，徐 偉，王芝祥

(1.上海交通大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200240;2.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200040)

離子交換-反相色譜純化育亨賓

陶 蕾1，趙明珠1，趙鳳生1，徐 偉2，王芝祥2

(1.上海交通大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200240;2.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200040)

目的 從育亨賓樹皮中提取的育亨賓粗品，一般純度較低(10%左右)。本文研究純化育亨賓粗品的方法。方法 結(jié)合離子交換與反相色譜兩種方法，考察了洗脫條件對純化效果的影響。結(jié)果 采用1×2型陽離子交換樹脂，以乙醇-水-氨水(40∶55∶5)為洗脫液，洗脫的育亨賓純度最高;然后用C18反相色譜進(jìn)一步純化，流動相為甲醇-水(含0.01%三氟乙酸)，甲醇濃度按3%，30%，40%，95%分階段增加，洗脫液中的育亨賓純度提高至71.2%。結(jié)論 這項(xiàng)工藝具有成本低、收率高、純度好、步驟少的特點(diǎn)，在天然產(chǎn)物的分離純化方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

育亨賓;純化;離子交換;反相色譜

育亨賓是一種吲哚類生物堿，用于治療男性勃起功能障礙［1］，以及動脈硬化、心絞痛等疾病，具有廣泛的藥理作用［2］。

育亨賓主要從產(chǎn)于西非的植物育亨賓樹(Corynanthe yohimbe)的皮中提?。?］。近年來，國內(nèi)從夾竹桃科蘿芙木屬的植物蛇根木(Rauvolfia serpentina Benth)、云南蘿芙木(Rauvolfia yunnanensis Tsiang)、催吐蘿芙木(Rauwolfia vomitoria)中提取、分離育亨賓的工藝有一些研究報(bào)道［4-6］?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)著重于從植物浸提液中分離純化育亨賓，提取所得的育亨賓純度較低，僅為8% ～10%，因此還須對育亨賓粗品作進(jìn)一步的純化，以獲得純度更高的育亨賓原料。

本研究結(jié)合離子交換與反相色譜技術(shù)，采用1×2型陽離子交換樹脂提取和C18反相色譜兩個(gè)步驟，對育亨賓粗品進(jìn)行純化。

1 材料

育亨賓粗品(陜西禾博天然產(chǎn)物有限公司);育亨賓對照品(含量＞98% ，美國Sigma公司);甲醇(色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙醇(分析純，上海振興化工一廠)，三氟乙酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);其他試劑均為分析純。

1×2型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(苯乙烯-二乙烯苯骨架，交換容量0.685 mmol/mL，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院)。

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀及工作站(德國安捷倫公司)。

C18反相色譜裝置由以下部件組成:C18反相色譜柱(21 mm×250 mm，20μm，上海申越實(shí)驗(yàn)器材有限公司)，TBP5010型恒流泵(上海同田生物技術(shù)有限公司)，UVD-680-3型紫外檢測儀(上海金達(dá)生化儀器有限公司)，在線檢測色譜工作站(上海金達(dá)生化儀器有限公司)。

2 方法

2.1 1×2型樹脂的離子交換

將1×2型陽離子交換樹脂用乙醇浸泡過夜，待充分溶脹后裝入柱中，通入3倍樹脂體積的1 mol/L NaOH溶液(含有50%乙醇)處理，用去離子水洗滌至pH近中性，再用3倍樹脂體積的1 mol/L HCl溶液處理，用去離子水洗滌至pH近中性。

取處理后的1×2型陽離子交換樹脂50 mL，裝入內(nèi)徑為20 mm的玻璃柱中。稱取育亨賓粗品2 g，加入甲醇25 mL溶解，加入樹脂柱中。用一定濃度的乙醇-氨水溶液洗脫，流速2.0 mL/min。洗脫流出液經(jīng)過紫外檢測儀，檢測波長254 nm。根據(jù)檢測峰收集洗脫的樣品。

2.2 C18反相色譜

收集的1×2型陽離子交換樹脂洗脫液經(jīng)過減壓濃縮(50℃)，蒸去乙醇，調(diào)節(jié)pH值為中性，3 500 r/min離心15 min，取上清液，加入C18反相色譜柱中，以甲醇-水(含有0.01%三氟乙酸)為流動相，組成階段變化，洗脫流速3.0 mL/min。流出液經(jīng)過紫外檢測儀，檢測波長254 nm。根據(jù)檢測峰收集洗脫的樣品。

2.3 育亨賓的高效液相色譜分析

色譜柱:ZORBAX SB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:甲醇-水(含 0.01% 三氟乙酸)(30∶70);進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min;檢測波長:226 nm。育亨賓含量用外標(biāo)法測定［7］。

2.4 育亨賓純度和回收率計(jì)算

育亨賓的純度根據(jù)高效液相色譜圖，采用面積歸一法計(jì)算;回收率根據(jù)純化前后樣品中的育亨賓含量計(jì)算而得。

3 結(jié)果

3.1 1×2型樹脂離子交換分離育亨賓

在1×2型陽離子交換樹脂分離育亨賓粗品的過程中，用不同濃度的乙醇-氨水溶液洗脫，育亨賓的純度和回收率見表1。

表1 不同濃度的乙醇-氨水溶液的洗脫效果Tab.1 Elution effects of ethanol-ammonia solution with different concentrations

育亨賓是一種生物堿，在酸性條件下離解后帶正電荷，容易被陽離子交換樹脂吸附;在堿性條件下不離解，易于從陽離子樹脂上洗脫下來。所以洗脫液中要加入少量氨水，使pH為堿性。乙醇能使樹脂溶脹，減弱樹脂對育亨賓的吸附作用，增加流動相對育亨賓的溶解，因而有助于育亨賓的洗脫。由表1可知，乙醇濃度對育亨賓洗脫的影響很大。乙醇濃度越高，育亨賓的洗脫越完全，收率也就越高。乙醇濃度對純度的影響較為復(fù)雜。當(dāng)乙醇濃度增加時(shí)，由于洗脫的育亨賓量增加，純度升高;但乙醇濃度過高時(shí)，洗脫的雜質(zhì)迅速增多，純度反而降低。含40%乙醇的洗脫液洗脫的育亨賓純度最高。因此，確定在純化工藝中采用40%乙醇。

1×2型陽離子交換樹脂分離育亨賓的圖譜見圖1。圖1的實(shí)驗(yàn)中，開始階段僅用5%氨水(不含乙醇)洗脫，能夠去除部分雜質(zhì)。然后用40%乙醇(含5%氨水)洗脫育亨賓。尚有部分雜質(zhì)吸附在柱上，可用90%乙醇(含5%氨水)洗脫。

圖1 1×2型陽離子交換樹脂分離育亨賓的圖譜Fig.1 Chromatogram of yohimbine by 1 × 2 type cation-exchange resin

3.2 C18反相色譜純化育亨賓

由于離子交換后收集的樣品體積較大，濃度較低，其中含有的乙醇不利于下一步的反相色譜分離，所以要將得到的洗脫液進(jìn)行濃縮。然后將濃縮后的洗脫液通入C18反相色譜柱，以濃度階段變化的甲醇溶液(含0.01%三氟乙酸)洗脫，考查對育亨賓的純化效果。所得的紫外在線檢測圖譜見圖2，洗脫液中育亨賓的純度與回收率見表2。

圖2 C18反相色譜純化育亨賓的圖譜Fig.2 Chromatograms of yohimbine by C18 reversed-phase chromatography

表2 反相色譜中幾種洗脫方式的純化效果Tab.2 Purification effect of several elution methods in reversed-phase chromatography

由圖2A可知，當(dāng)洗脫液中甲醇的濃度為3%-40%-95%時(shí)，含40%甲醇的洗脫液可以將育亨賓洗脫，但育亨賓與前面的雜質(zhì)有混淆，分離不好。圖2B中，在40%甲醇前增加了30%甲醇洗脫，30%甲醇除去了許多雜質(zhì)，40%甲醇洗脫的育亨賓中的雜質(zhì)就會減少。圖2C中，在40%甲醇后增加了50%甲醇洗脫，40%甲醇不能將在育亨賓之前流出的雜質(zhì)分離，50%甲醇能將柱上剩余的雜質(zhì)洗脫。從表2可以看出，甲醇含量變化為3%-30%-40%-95%時(shí)，洗脫的育亨賓樣品純度較高，收率也高于其他兩種方法。

育亨賓粗品及其經(jīng)過離子交換、反相色譜兩步提純后的高效液相色譜圖見圖3。在育亨賓粗品中，雜質(zhì)很多，育亨賓只占少部分;經(jīng)過離子交換，去除了一些雜質(zhì)，育亨賓含量顯著提高;再經(jīng)過反相色譜，育亨賓已占大部分，但在育亨賓峰的前后還各有一個(gè)雜質(zhì)峰，難以去除。

圖3 育亨賓樣品的高效液相色譜圖譜Fig.3 Chromatograms of yohimbine samples by HPLC

4 討論

離子交換色譜與反相色譜是兩種分離機(jī)制完全不同的色譜方法。離子交換色譜以離子交換樹脂為固定相，依據(jù)樣品中的離子與樹脂的結(jié)合力的差別進(jìn)行分離。育亨賓是吲哚類生物堿，因此采用1×2型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂吸附，用氨水-乙醇溶液洗脫，去除育亨賓粗品中的非生物堿類雜質(zhì)。采用含40%乙醇的洗脫劑，可以獲得較高的純度與回收率。反相色譜用硅膠鍵合非極性的疏水基團(tuán)作為固定相，以強(qiáng)極性溶劑作為流動相，基于樣品中的各種組分與疏水基團(tuán)之間作用的不同而分離。流動相用甲醇、水和三氟乙酸配制的混合溶液，以分階段改變流動相組成的方式洗脫樣品。當(dāng)甲醇含量按3%-30%-40%-95%變化時(shí)，能夠得到較為理想的純化效果。

本研究將離子交換與反相色譜相結(jié)合，對育亨賓粗品進(jìn)行純化，將育亨賓的含量由10%左右提高至70%以上，取得顯著的效果。這種方法對于育亨賓的純化具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，并有望應(yīng)用于其它天然產(chǎn)物的分離純化。其缺點(diǎn)是反相色譜介質(zhì)C18的價(jià)格很貴，放大生產(chǎn)成本太高，所以目前僅用于實(shí)驗(yàn)室中少量樣品的純化制備。

［1］鄭培良.育亨賓治療陽痿的藥理機(jī)制與臨床應(yīng)用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，1993，9(6):418-420.

［2］黃訊瑞，林 徽.育亨賓藥物的臨床應(yīng)用［J］.海峽藥學(xué)，1999，11(2):4-5.

［3］李 鵬，陳琴華，張 卓，等.離子交換樹脂對育亨賓總生物堿的純化研究［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29(2):129-132.

［4］劉 璇，曹福祥，趙 瑩，等.用大孔吸附樹脂分離純化育亨賓［J］.湘潭師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，31(2):44-47.

［5］錢子剛，張正先.治療陽痿藥“萎必治”新藥源探究［J］.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1996，19(3):15-16.

［6］劉 宇，馮 蕾，趙鳳生.從催吐蘿芙木中提取利血平和育亨賓的工藝研究［J］.藥物生物技術(shù)，2008，15(5):393-397.

［7］劉 宇，孫 蕾，馮 蕾，等.高效液相色譜法測定蘿芙木中育亨賓和利血平的含量［J］.中國生化藥物雜志，2008，29(2):107-109.

Purification of crude yohimbine by ion-exchange and reversed-phase chromatography

TAO Lei1，ZHAO Ming-zhu1，ZHAO Feng-sheng1，XU Wei2，WANG Zhi-xiang2
(1.School of Pharmacy，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240;2.Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai 200040，China)

Purpose Crude yohimbine separated from Corynanthe yohimbe is only with low purity(about 10%).A method to purify crude yohimbine should be studied.Methods Ion-exchange and reversedphase chromatography were combined in this study.The influence of elution conditions on purifying effects was investigated.Results By adsorption with 1 ×2 cation exchange resin and elution with mixture of ethanol，water and ammonia(40∶55∶5)，highest purity of yohimbine was obtained.Next separation with C18reversed-phase chromatography was eluted with the mixture of methanol and water(containing 0.01%trifluoroacetic acid).When the concentration of methanol increased progressively based on 3%-30%-40%-95%，the purity of yohimbine in eluent could increase to 71.2%.Conclusion This technique has advantages of low cost，high yield，good purity and fewer procedures and has potential application value in the separation and purification of natural products.

yohimbine;purification;ion-exchange;reversed-phase chromatography

TQ460.6;R284.2

A

1005-1678(2011)05-0349-03

2010-05-18

上海市科學(xué)技術(shù)委員會中藥現(xiàn)代化項(xiàng)目(08DZ1973800)資助

陶 蕾，女，博士研究生，研究方向?yàn)樯镂镔|(zhì)的分離純化;趙鳳生，男，通信作者，教授，博士生導(dǎo)師，Tel:021-34204528，E-mail:fszhao@sjtu.edu.cn。