人白細胞介素-31的真核表達及其對HaCaT細胞IL-6和TNFα表達的影響

黃海良，羅 欣，顧 芳，張勝權(quán)

(安徽醫(yī)科大學 生物化學與分子生物學教研室，安徽 合肥 230032)

人白細胞介素-31的真核表達及其對HaCaT細胞IL-6和TNFα表達的影響

黃海良，羅 欣，顧 芳，張勝權(quán)

(安徽醫(yī)科大學 生物化學與分子生物學教研室，安徽 合肥 230032)

目的 構(gòu)建人白細胞介素-31(hIL-31)基因真核表達載體并將其轉(zhuǎn)染到HaCaT細胞，觀察其對HaCaT細胞炎癥因子分泌的影響。方法 分離人外周血單核細胞，加入終濃度為20 nmol/L的豆蔻佛波醇乙酯(PMA)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h收集細胞。RT-PCR克隆hIL-31 cDNA，并將其克隆到真核表達載體pSecTag2/Hygro B上。將構(gòu)建成功的重組體轉(zhuǎn)染至HaCaT細胞，用Western blot分析hIL-31在細胞中的表達以及RT-PCR方法分析其對IL-6、TNFα表達的影響。結(jié)果 經(jīng)雙酶切、測序及Blast分析鑒定，我們成功獲得hIL-31基因cDNA全長序列和pSecTag2/Hygro B-IL-31重組體。轉(zhuǎn)染至HaCaT細胞的外源性hIL-31可以促進IL-6、TNFα的表達。結(jié)論 hIL-31可以通過自分泌的方式促進HaCaT細胞炎性相關(guān)細胞因子的表達。

人白介素-31;真核表達;皮膚角質(zhì)形成細胞

人白細胞介素-31(human interleukin-31，hIL-31)是新發(fā)現(xiàn)的gp130/il-6細胞因子家族成員，其主要由激活的CD4+T淋巴細胞產(chǎn)生?；蚨ㄎ挥?2q24.31，全長 904 bp，開放閱讀框為 495 bp，編碼一條由164個氨基酸殘基組成的多肽鏈，成熟的蛋白質(zhì)分子含有141個氨基酸［1］。而hIL-31受體是由GPL(gp130-like receptor)和人制瘤素M受體(OSMR)組成的異源二聚體［2］。HIL-31與其受體結(jié)合后可以激活Jak/STAT，P13K/AKT和MAPK通路進而發(fā)揮其廣泛的生物學作用。Dillon等［3］研究表明hIL-31在皮膚炎癥中發(fā)揮著重要作用。本實驗通過hIL-31的基因克隆、真核表達以及轉(zhuǎn)染至人皮膚角質(zhì)形成細胞后對細胞炎性因子表達的影響，探討其對皮膚角質(zhì)形成細胞炎性因子表達的調(diào)控作用以及其在機體炎性反應(yīng)中的作用。

1 材料

1.1 試劑

Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司;PCR試劑和Taq DNA聚合酶購自美國Fermentas公司;T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ購自日本TaKaRa公司;Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitrogen公司;小牛血清購自杭州四季青公司;質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自美國AxyGen公司。

1.2 細菌、細胞、質(zhì)粒

E.coli JM109、人皮膚角質(zhì)形成細胞和質(zhì)粒pSecTag2/Hygro B均由本實驗室提供。

1.3 引物設(shè)計

用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計4對引物(表1)，引物由上海生工技術(shù)有限公司合成。

2 方法

2.1 淋巴細胞的分離和培養(yǎng)

用淋巴細胞分離液分離人外周血單核細胞，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩遍，加入含10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入終濃度為20 nmol/L的豆蔻佛波醇乙酯(PMA)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞。

2.2 RT-PCR擴增 hIL-31 cDNA

收集細胞后，用無菌PBS洗滌兩次，Trizol法提取細胞總RNA。參照Promega公司的RT-PCR Kit試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)過程如下:取總RNA 5μL，70℃孵育10 min，冰浴3 min。分別加入10×RT Buffer 1μL、25 mmol/L MgCl22μL、10 mmol/L dNTP 1 μL、OligodT 0.5 μL、RNase Inhibitor 0.25 μL 和 AMV Reverse Transcriptase 0.25 μL，充分混勻。42℃ 60 min，95℃ 5 min，冰浴5 min，加ddH2O 40μL。以上述產(chǎn)物為模板，根據(jù)基因庫中的hIL-31基因序列設(shè)計引物，并在引物的5'端引入相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶識別序列及保護堿基。表中下劃線部分分別為HindⅢ和XhoⅠ的酶切位點。

PCR反應(yīng)體系及條件分別為:10×Buffer 2.5 μL、10 mmol/L dNTP 0.5 μL、25 mmol/L MgCl21.5 μL、上游引物和下游引物各 0.5 μL、1 U/μL TaqDNA 聚合酶 1 μL、模板 cDNA 5 μL、ddH2O 13.5 μL。獲得目的基因后進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定結(jié)果。

表1 PCR引物及擴增條件Tab.1 The PCR primers and conditions of amplification

2.3 重組載體的構(gòu)建和篩選

質(zhì)粒載體pSecTag2/Hygro B和hIL-31分別用HindⅢ和XhoⅠ進行雙酶切，條件為37℃，4 h。酶切產(chǎn)物使用膠回收試劑盒進行回收，將酶切回收后的hIL-31和質(zhì)粒載體pSecTag2/Hygro B按1∶5的比例加入到連接體系中，T4連接酶16℃連接過夜。氯化鈣法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109菌株，采用抗生素篩選法、菌落PCR和雙酶切法進行重組體鑒定，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進行測序。

2.4 重組體轉(zhuǎn)染HaCaT細胞

將凍存的HaCaT細胞復(fù)蘇后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代3～4次，使細胞達到良好的生長狀態(tài)時，按1×105/L的密度消化接種于6孔板繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合度為90%。用Lipofectimine 2000將hIL-31轉(zhuǎn)染至HaCaT細胞，培養(yǎng)24 h。同時設(shè)定空白和轉(zhuǎn)染空載體pSecTag2/Hygro B為對照，并設(shè)置復(fù)空。

2.5 hIL-31對IL-6和TNFαmRNA表達的影響

Trizol法分別提取各組細胞總RNA，RT-PCR法檢測各組細胞IL-6和TNFαmRNA表達的水平。方法如2.2項下步驟，PCR引物及擴增條件見表1。

3 結(jié)果

3.1 RT-PCR擴增人hIL-31全長cDNA

經(jīng)RT-PCR擴增，1.2%瓊脂糖凝膠電泳可見一條495 bp的特異性擴增條帶(圖1)。

3.2 真核表達載體pSecTag2/Hygro B-IL-31的構(gòu)建及鑒定

目的基因連接入真核表達載體pSecTag2/Hygro B后，轉(zhuǎn)化入E.coli JM109菌株并采用抗氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選。用菌落PCR和雙酶切法鑒定，并進行測序。測序結(jié)果通過Blast同源性分析，與GeneBank中hIL-31序列一致，表明重組體構(gòu)建成功(圖1)。

圖1 RT-PCR結(jié)果及pSecTag2/Hygro B-IL-31重組體經(jīng)HindⅢ和XhoⅠ酶切電泳圖Fig.1 The products of RT-PCR and pSecTag2/Hygro B-IL-31 digested by HindⅢ and XhoⅠ

3.3 Western blot分析重組pSecTag2/Hygro B-IL-31在HaCaT細胞中的表達

細胞裂解液裂解細胞，提取蛋白。各樣品10 μL加入12%SDS聚丙烯酰胺凝膠孔中，80 V Tris-甘氨酸電泳緩沖液電泳，至分離膠以后電壓調(diào)至120 V。電泳轉(zhuǎn)移緩沖液中120 mA，1.5 h恒流將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶4℃過夜封閉?？筯IL-31(1∶500)常溫下?lián)u床上結(jié)合 2.5 h，TBS-T洗膜3次，每次10 min;相應(yīng)的HRP標記的二抗結(jié)合2 h，TBS-T洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光，常規(guī)顯影(圖2)。

3.4 hIL-31對IL-6和TNFαmRNA表達的影響

使用 Lipofectimine 2000將 hIL-31轉(zhuǎn)染至HaCaT細胞24 h后，提取各組細胞總RNA，經(jīng)RTPCR法分析hIL-31對IL-6和TNFα表達的影響，并進行瓊脂糖凝膠電泳分析檢測，結(jié)果顯示hIL-31能上調(diào)IL-6和TNFαmRNA的表達(圖3)。

圖2 Western blot鑒定hIL-31在HaCaT細胞中的表達Fig.2 The expression of hIL-31 in HaCaT cells identified by Western blot

圖3 外源性hIL-31對HaCaT細胞表達IL-6和TNF-α的影響Fig.3 The expression of IL-6 and TNF-α in HaCaT cells affected by hIL-31

4 討論

T細胞介導的炎癥反應(yīng)在許多皮膚疾病中發(fā)揮著重要的作用，包括特應(yīng)性皮炎、過敏性接觸性皮炎、炎癥性腸病及銀屑病等［4］。而hIL-31是由激活的Th2 CD4+T細胞產(chǎn)生的細胞因子，研究表明其在調(diào)節(jié)細胞增殖、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答和介導細胞活素類物質(zhì)等方面發(fā)揮著重要作用［5］。

hIL-31在正常生理情況下表達水平較低，其在小腸、結(jié)腸、氣管、睪丸和骨骼肌等處有低水平表達［6］。研究證明，hIL-31受體在過敏性皮炎患者角質(zhì)細胞中表達水平增高［7］。Takaoka等［8］研究發(fā)現(xiàn)當其在鼠體內(nèi)過度表達時，會導致瘙癢癥和類似于人類特應(yīng)性皮炎的皮膚炎癥。本實驗利用PMA刺激正常人外周血淋巴細胞并通過RT-PCR成功獲得hIL-31全長cDNA，并將其克隆到真核表達載體上。我們分別將原始質(zhì)粒和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至正常人皮膚角質(zhì)細胞，同時設(shè)置空白對照組來檢測炎性相關(guān)因子IL-6和TNF-αmRNA的表達水平，結(jié)果顯示其具有上調(diào)hIL-31和TNF-αmRNA表達的作用，可為我們繼續(xù)研究IL-31在炎性中的作用以及與細胞炎性因子之間的相互作用奠定基礎(chǔ)。

hIL-31屬于IL-6家族成員，它們有類似的受體，為GPL與OSMR形成的異源二聚體。hIL-31受體主要分布在上皮細胞和淋巴細胞，在皮膚等組織中表達水平較高。hIL-31通過與受體結(jié)合后激活Jak/STAT，P13K/AKT和MAPK通路進而發(fā)揮其生物學作用。Sonkoly等［9］研究證明hIL-31受體在過敏性皮炎患者背根神經(jīng)節(jié)大量表達，表明hIL-31的表達與過敏性皮炎患者的皮膚瘙癢癥密切相關(guān)。

本實驗通過研究hIL-31對IL-6和TNF-α細胞炎性因子mRNA表達水平的影響，可以初步闡明其具有促炎作用。其可以通過增強其他細胞炎性因子的活性，通過細胞因子之間的相互作用，從而發(fā)揮著重要的作用。下一步我們可以進行信號通路的研究、細胞因子之間的相互作用以及純化hIL-31蛋白并探討其生物學功能。

［1］Zhang Q，Prabhakar P，Zhou Q，et al.Structures and biological functions of IL-31 and IL-31 receptors［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2008，19(5-6):347-356.

［2］Diveu C，Lelievre E，Perret D，et al.GPL，a nover cytokine receptor related to GP130 and lerkemia inhibitory factor receptor［J］.JBiol Chem，2003，278:49850-49859.

［3］Dillon SR，Sprecher C，Hammond A，et al.Interleukin 31，a cytokine produced by actived T cell，induces dermatitis in mice［J］.Nat Immunol，2004，5:752-760.

［4］Yagi Y，Andoh A，Nishida A，et al.Interleukin-31 stimulates production of inflammatory mediators from human colonic subepithelial myofibroblasts［J］.Int JMol Med，2007，19(6):941-946.

［5］黃俊瓊，孫萬邦，謝宇鋒，等.人IL-31的克隆表達及對表皮角化細胞的影響［J］.中國免疫學雜志，2007，23(4):369-373.

［6］Bilshorough J，Leung D Y，Maurer M，et al.IL-31 is associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis［J］.J Allergy Clin Immunol，2006，117(2):418-425.

［7］Bando T，Morikawa Y，Komori T，et al.Complete overlap of interleukin-31 receptor A and oncostatin M receptor beta in the adult dorsal root ganglia with distinct developmental expression patterns［J］.Neuroscience，2006，142(4):1263-1271.

［8］Takaoka A，Arai I，Sugimoto M，et al.Expression of IL-31 gene transcripts in NC/Ngamice with atopic dermatitis［J］.Eur J Pharmacol，2005，516(2):180-181.

［9］Sonkoly E，Muller A，Lauerma A I，et al.IL-31:a new link between T cells a pruritus in atopic skin inflammation［J］.J Allergy Clin Immunol，2006，117(2):411-417.

Eukaryotic expression of hIL-31 and effects on the IL-6 and TNFαin HaCaT

HUANG Hai-liang，LUO Xin，GU Fang，ZHANG Sheng-quan
(Department of Biochemistry and Molecular Biology，Anhui Medical University，Hefei 230032，China)

Purpose To clone the encoding sequence of human IL-31 gene，to construct recombinant eukaryotic expression plasmid vector and to study its effects on the expression of IL-6 and TNFαin HaCaT.Methods Full-length hIL-31 cDNA was amplified by RT-PCR and cloned into the pSecTag2/HygroB plasmid vector.Western-blot analyzes the expression of hIL-31 in HaCaT.RT-PCR analyzes the effects of hIL-31 on the expression level of IL-6 and TNFα.Results The recombinant plasmid was cut with restriction endonuclease HindⅢ and XhoⅠ.By the confirmation by sequencing and nucleotide homology analyzed to GenBank，we obtained the hIL-31 cDNA and the recombinant plasmid pSecTag2/HygroB-Il-31 successfully.And the exogenous hIL-31 can promote the expression of IL-6 and TNFα.Conclusion HIL-31 can promote the expression of inflammation factors by the way of autocrining in HaCaT.

human interleukin-31;eukaryotic expression;keratinocytes

Q78

A

1005-1678(2011)05-0345-04

2010-11-22

安徽省重點實驗室優(yōu)秀中青年科研帶頭人專項基金;安徽醫(yī)科大學博士基金

黃海良，男，助理實驗師，在讀碩士研究生，主要從事細胞因子與相關(guān)性疾病研究;張勝權(quán)，通信作者，博士，副教授，碩士生導師，E-mail:sqz36@yahoo.com。