乳糖誘導(dǎo)瑞替普酶在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)

田文靜，羅學(xué)剛，呂麗慧，倪 萌，井曉蘭，張同存

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457;2.武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430065;3.天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

乳糖誘導(dǎo)瑞替普酶在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)

田文靜1，羅學(xué)剛1，呂麗慧1，倪 萌1，井曉蘭1，張同存2，3

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457;2.武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430065;3.天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

目的 構(gòu)建瑞替普酶(rPA)大腸桿菌基因工程菌，優(yōu)化乳糖誘導(dǎo)表達(dá)條件，并獲得活性重組蛋白。方法通過(guò)PCR擴(kuò)增得到rPA編碼基因，將該基因片段克隆到載體pET40b中，轉(zhuǎn)化E.coli BL21。優(yōu)化確定乳糖誘導(dǎo)濃度、時(shí)間、溫度等參數(shù)，將誘導(dǎo)表達(dá)后獲得的菌體細(xì)胞通過(guò)超聲破碎裂解后利用鎳柱親和色譜進(jìn)行分離純化，重組目的蛋白經(jīng)Xa因子切割去除DsbC融合標(biāo)簽后釋放獲得rPA產(chǎn)物，最后利用纖維蛋白平板法對(duì)其溶栓活性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 rPA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，利用終濃度30 mmol/L的乳糖于30℃誘導(dǎo)5 h可以獲得很好的表達(dá)效果，重組蛋白的表達(dá)量、可溶性及酶活與IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物基本接近;經(jīng)純化后的rPA目的蛋白可表現(xiàn)出明顯的溶栓活性。結(jié)論 本研究為進(jìn)一步利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)高活性重組rPA提供了一定的參考依據(jù)。

瑞替普酶;DsbC;乳糖;大腸桿菌;表達(dá)

由血管栓塞引發(fā)的各類(lèi)心血管疾病嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命，是造成死亡和病殘的主要原因之一。全世界每年心血管病患者多達(dá)1 300萬(wàn)，其中急性心肌梗死(AMI)死亡率高達(dá)30%。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在美國(guó)每年大約有90萬(wàn)人患有急性心肌梗死，死亡人數(shù)達(dá)到22.5萬(wàn)，其中有一半左右未得到治療就已死亡［1］。

組織型纖溶酶原激活劑(tPA)是人體內(nèi)正常存在的特異性纖維蛋白溶解物，被用于臨床血液栓塞病的治療。然而，由于tPA的體內(nèi)半衰期極短，只有3～5 min，治療時(shí)所需劑量高達(dá)50～100 mg，因而在使用時(shí)不僅費(fèi)用昂貴，而且增加了周身纖溶性出血的危險(xiǎn)性［2］。對(duì)tPA分子進(jìn)行改造，延長(zhǎng)其半衰期并增強(qiáng)其纖溶活性是克服這些缺點(diǎn)的主要途徑之一。tPA的區(qū)域缺失性突變體——瑞替普酶(Reteplase，rPA)即是經(jīng)過(guò)人為改造，由天然tPA的1～3位氨基酸和176～527位氨基酸組成的新型溶栓制劑，含羧基端的K2區(qū)和蛋白酶區(qū)，缺乏氨基端的F區(qū)、EGF區(qū)和K1區(qū)［3］。與tPA相比，rPA的半衰期延長(zhǎng)為(14.4±1.1)min，其滲入血栓內(nèi)的能力明顯增強(qiáng)，用藥后能快速起效，而引發(fā)出血不良反應(yīng)的幾率則大大降低，被認(rèn)為是新一代可以替代鏈激酶和tPA的安全、有效的溶栓藥物［4-6］。

rPA含有9對(duì)二硫鍵，因此如何在大腸桿菌表達(dá)體系中形成正確的空間構(gòu)象，避免包涵體的形成使其可溶性表達(dá)，便成了利用大腸桿菌系統(tǒng)開(kāi)發(fā)生產(chǎn)rPA的瓶頸［7］。在本研究中，我們將rPA的編碼序列置于二硫鍵異構(gòu)酶(Recombinant Disulfide Bond Isomerase，DsbC)信號(hào)肽及其基因序列之后構(gòu)建成融合蛋白(DsbC-rPA)，使其可在大腸桿菌中獲得較好的可溶性表達(dá)。同時(shí)，為了降低生產(chǎn)成本，本研究選擇乳糖作為誘導(dǎo)劑，對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，為進(jìn)一步建立高活性、低成本的rPA重組生產(chǎn)方法奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

E.coli DH5α 菌株、E.coli BL21菌株及 pET-40b質(zhì)粒，均由天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微生物菌種保藏管理中心提供，pMD18T-tPA質(zhì)粒由天津科技大學(xué)李玉老師惠贈(zèng)。

pfu DNA聚合酶、dNTPs、DNA快速純化回收試劑盒為上海生工生物工程公司產(chǎn)品;各種限制性?xún)?nèi)切酶均為MBI公司產(chǎn)品;DL2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司;T4 DNA連接酶為Promega公司產(chǎn)品;瓊脂糖、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)、酵母提取物、瓊脂粉和胰蛋白胨均為BBI公司產(chǎn)品;人纖維蛋白原購(gòu)自上海萊士血制品公司;凝血酶為湖南一格制藥有限公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 重組質(zhì)粒pET40b-rPA的構(gòu)建

根據(jù)tPA基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增rPA編碼序列的特異性引物。上游引物:5'-CGGGGATCCG ATCGAAGGTCGT TCTTACCAAGGAAACAGTG-3';下游引物:5'-GGGCTCGAGA TTA CGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAG-3'。其中在上下游引物中分別引入Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線部分)。此外，為方便在后期切割去除DsbC融合標(biāo)簽，在上游引物中引入Ⅹa因子蛋白酶切位點(diǎn)(斜體部分)，同時(shí)，為了保證蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程的正常終止，在下游引物中引入終止密碼子(斜體部分)。以pMD18T-tPA質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng):94℃預(yù)變性5 min后進(jìn)行30次循環(huán)(94 ℃，45 s;64 ℃，45 s;72 ℃，1.5 min)，最后于72℃反應(yīng)10 min。PCR產(chǎn)物和pET40b質(zhì)粒經(jīng)Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切后，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切驗(yàn)證及測(cè)序分析結(jié)果正確后轉(zhuǎn)到大腸桿菌表達(dá)菌株E.coli BL21中。

2.2 乳糖濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和溫度的優(yōu)化

當(dāng)菌液A600達(dá)到0.6～1.0時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別于25，30和37℃以不同的乳糖濃度(終濃度10，20，30，40，50 mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo) 1，2，3，4，5，6 h時(shí)分別取樣進(jìn)行菌體濃度測(cè)定和蛋白表達(dá)量測(cè)定，每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2次，以確定適合菌株生長(zhǎng)和目的蛋白表達(dá)的乳糖濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和溫度。最后再用最佳誘導(dǎo)條件與IPTG的誘導(dǎo)效果進(jìn)行比較分析。

2.3 重組蛋白的分離純化

超聲波破碎菌體后離心，將上清蛋白樣品加到裝有預(yù)先用2-嗎啉乙磺酸(MES)(50 mmoL/L，pH 6.1)溶液50 mL平衡過(guò)的10 mL強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂UNOsphereQ的色譜柱中，用含有0.1 mol/L LiCl的 MES(25 mmoL/L，pH 6.1)溶液150 mL 梯度洗脫rPA蛋白，用部分收集器收集蛋白樣品(1.5 mL/管)。純化獲得的融合蛋白利用Ⅹa因子切割去除DsbC標(biāo)簽后再次利用柱色譜進(jìn)行分離純化，從而獲得rPA目的蛋白。

2.4 纖維蛋白平板法(FAPA)驗(yàn)證產(chǎn)物活性

用FAPA測(cè)定重組目的蛋白的體外溶栓活性。所有溶液均用磷酸鹽緩沖液(PBS)配制。先稱(chēng)量纖維蛋白0.02 g后迅速加到裝有PBS 5 mL的錐形瓶中，用槍輕輕吹吸，搖勻，放37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱，10 min左右即可溶解。接著取少量凝血酶放入裝有PBS 1 mL的EP管，輕吹一下，放入37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱。最后用PBS7 mL溶解瓊脂糖0.07 g，加熱至沸騰，冷卻至適合溫度，加入纖維蛋白和凝血酶搖勻后倒入平板中。凝固后打孔，紫外燈下滅菌30 min。將樣品加入孔中，37℃下培養(yǎng)12 h，觀察溶栓圈產(chǎn)生情況［8］。

3 結(jié)果

3.1 重組質(zhì)粒pET40b-rPA的構(gòu)建

如圖1所示，PCR反應(yīng)后在1.1 kb處可見(jiàn)明顯的特異性條帶，片段大小與預(yù)期的一致。將此PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體pET40b質(zhì)粒DsbC下游，獲得rPA重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)Bam HⅠ及XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證后可見(jiàn)到明顯的1.1 kb目的條帶，進(jìn)一步經(jīng)測(cè)序證實(shí)目的基因序列、插入方向及開(kāi)放閱讀框均完全正確性，表明重組質(zhì)粒pET-40b-rPA構(gòu)建成功。

圖1 pET40b-rPA重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of pET40b-rPA plasmid

3.2 乳糖誘導(dǎo)最佳濃度的確定

誘導(dǎo)溫度為30℃和誘導(dǎo)時(shí)間為5 h時(shí)，在重組菌生長(zhǎng)至A600值為0.6時(shí)加入不同濃度的乳糖，使終濃度分別為 10，20，30，40，50 mmol/L，繼續(xù)誘導(dǎo)4 h，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳并與之前優(yōu)化好的IPTG誘導(dǎo)條件(濃度為0.6 mmol/L)相比較，結(jié)果顯示，當(dāng)乳糖終濃度為30 mmol/L時(shí)目的蛋白的表達(dá)量最高，此后隨著乳糖濃度的增高表達(dá)量反而有所下降。這可能是由于乳糖從胞外轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)需要β-半乳糖苷透過(guò)酶的作用，這是一種主動(dòng)運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程，高濃度的乳糖會(huì)造成菌體質(zhì)子推動(dòng)力的消耗，從而“分散”了菌體的能量［9］。當(dāng)終濃度為30 mmol/L時(shí)不僅得到了較高的表達(dá)量而且菌體生物量很大，表明在此濃度時(shí)，菌體對(duì)乳糖的分配利用最為合理，既有效促進(jìn)了生長(zhǎng)又充分發(fā)揮了誘導(dǎo)效果，所以確定乳糖誘導(dǎo)最佳濃度為30 mmol/L。

3.3 乳糖誘導(dǎo)溫度的確定

以已經(jīng)確定的乳糖濃度(終濃度為30 mmol/L)，分別于25，30，37℃條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)5 h時(shí)取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并與以前優(yōu)化確定出的IPTG誘導(dǎo)條件(終濃度0.6 mmol/L)相比較，結(jié)果如圖3所示。誘導(dǎo)溫度為30℃時(shí)，利用乳糖誘導(dǎo)所獲得的目的蛋白量與IPTG誘導(dǎo)表達(dá)量相當(dāng)，表達(dá)情況優(yōu)于另外兩個(gè)溫度，因此確定乳糖誘導(dǎo)最佳溫度為30℃。

圖2 不同乳糖濃度誘導(dǎo)表達(dá)情況Fig.2 Expression induced with different concentrations of lactose

圖3 不同溫度時(shí)乳糖誘導(dǎo)表達(dá)情況Fig.3 Expression induced with lactose at different temperature

3.4 乳糖誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間的確定

以已經(jīng)確定的乳糖濃度(終濃度為30 mmol/L)于30℃下誘導(dǎo)表達(dá)，分別于誘導(dǎo)后1～6 h取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，并同時(shí)與IPTG的誘導(dǎo)條件(持續(xù)時(shí)間3 h)進(jìn)行比較，以確定乳糖誘導(dǎo)的最佳時(shí)間，結(jié)果如圖4所示。同一溫度和乳糖濃度下，在1～5 h內(nèi)，目的蛋白的表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸最佳，但至6 h后增加量較少，即誘導(dǎo)表達(dá)5 h可在最少的時(shí)間內(nèi)得到最大的誘導(dǎo)量，因此選定誘導(dǎo)時(shí)間為5 h。

3.5 乳糖最佳誘導(dǎo)條件與IPTG誘導(dǎo)效果的比較

為了比較乳糖與IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果，選擇乳糖誘導(dǎo)的最佳條件(誘導(dǎo)終濃度為30 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)時(shí)間為5h)與本研究前期優(yōu)化確定的IPTG最佳誘導(dǎo)條件(濃度0.6 mmol/L，溫度25℃，時(shí)間3 h)對(duì)收獲的生物量和目的蛋白表達(dá)量進(jìn)行比較，結(jié)果如圖5。以乳糖為誘導(dǎo)劑菌株生長(zhǎng)略?xún)?yōu)于以IPTG為誘導(dǎo)劑;誘導(dǎo)劑和溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)均有極顯著影響，以乳糖為誘導(dǎo)劑菌株的生長(zhǎng)優(yōu)于以IPTG為誘導(dǎo)劑。

圖4 乳糖誘導(dǎo)不同時(shí)間后表達(dá)情況Fig.4 Expression protein induced with lactose at different time

圖5 乳糖和IPTG最佳誘導(dǎo)條件的比較的SDS-PAGEFig.5 Effect of different inducers(lactose or IPTG)on rPA expression

3.6 FAPA驗(yàn)證產(chǎn)物活性

DsbC-rPA融合蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行超聲波裂解菌體后，離心取上清總蛋白樣品。將總蛋白利用離子交換進(jìn)行分離純化后獲得純度較高的DsbC-rPA重組目的蛋白，進(jìn)一步經(jīng)Ⅹa因子切割、純化后得到重組的rPA目的蛋白。利用FAPA檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)乳糖和IPTG誘導(dǎo)所得到的重組DsbC-rPA產(chǎn)物的可溶性表達(dá)成分均具有顯著的溶栓活性(圖6)。

4 討論

組織型纖溶酶原激活劑突變體rPA作為第三代溶栓藥物，在臨床上治療血栓類(lèi)疾病具有藥物半衰期長(zhǎng)、溶栓作用強(qiáng)、副作用小、總體用量少、治療費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是新一代安全、有效的溶栓藥物［10］。

圖6 纖維蛋白平板法檢測(cè)重組蛋白質(zhì)活性Fig.6 Thrombolytic activity assay of the recombinant proteins

由于rPA含有高達(dá)9個(gè)二硫鍵，因此在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)極易形成包涵體致使重組產(chǎn)物生物活性喪失。為了確保目的蛋白形成正確的二硫鍵與空間構(gòu)象，本研究將rPA編碼基因克隆到DsbC信號(hào)肽及其基因下游。DsbC信號(hào)肽可將融合蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)空間，然后在DsbC的輔助作用下催化二硫鍵的形成。DsbC是大腸桿菌重要的二硫鍵合成酶之一，可以顯著提高重組蛋白質(zhì)二硫鍵的正確形成并實(shí)現(xiàn)其可溶性表達(dá)［11］。前人的研究已發(fā)現(xiàn)，將DsbC與rPA共轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)后，可以顯著提高rPA的可溶性表達(dá)比例［12］。而在本研究中，我們直接采用將DsbC與rPA融合共表達(dá)的方式，成功實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的高效可溶性表達(dá)，目的蛋白在不需進(jìn)行包涵體復(fù)性操作且在未切去DsbC標(biāo)簽的情況下，即可表現(xiàn)出明顯的溶栓活性，從而大大簡(jiǎn)化了利用大腸桿菌這一目前最為成熟、成本最低廉的表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)可溶性、活性rPA的操作工藝。

IPTG是lac操縱子最有效的誘導(dǎo)劑，但由于其成本極高以及對(duì)宿主菌具有一定毒性等缺點(diǎn)，致使在大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白中受到了很大的限制［13］。根據(jù)lac操縱子的調(diào)控機(jī)理，乳糖也可以對(duì)lac操縱子控制的基因產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。乳糖所具備的無(wú)毒和價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)，使得其在重組蛋白的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中，具有優(yōu)于IPTG的潛在價(jià)值和優(yōu)勢(shì)［14］。本研究結(jié)果表明，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中后期添加乳糖至終濃度為30 mmol/L，并在30℃時(shí)誘導(dǎo)5 h，對(duì)該工程菌的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)十分有利，從而為后續(xù)研究工作奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。誠(chéng)然，本文所采用的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和培養(yǎng)條件還只是實(shí)驗(yàn)室小試規(guī)模，接下來(lái)我們將進(jìn)行在規(guī)?；a(chǎn)條件下大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)rPA的研究。

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Soluble expression of Reteplase in E.coli induced by lactose

TIAN Wen-jing1，LUO Xue-gang1，LU Li-hui1，NI Meng1，JING Xiao-lan1，ZHANG Tong-cun2，3
(1.Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，School of Bioengineering，Tianjin University of Scienceand Technology，Tianjin 300457，China;2.School of Medicine，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430065，China;3.Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，Tianjin 300457，China)

Purpose To establish the genetic E.coli for Reteplase，and to optimize the expression conditions induced by lactose.Methods The coding sequence of Reteplase(rPA)was amplified with PCR and then cloned into the pET40b vector.To achieve the high-level expression of soluble active reteplase，the induction expression conditions in E.coli strain BL21，including the concentration of inducer lactose，induction duration and temperature，were optimized.The thrombolytic activity of the recombinant K2Swas finally determined using an indirect fibrin plate assay.Results The recombinant plasmid pET40b-rPA was constructed successfully.Lactose could be a satisfying inductor and it obtained nearly the same yield，soluble form and activity with the expression inducted by IPTG.The result of fibrinolysis fibrin plate assay showed that the purified target protein exhibited significant fibrinolysis activity in vitro.Conclusion These researches might establish a significant foundation for the following production of rPA.

Reteplase;DsbC;lactose;E.coli;expression

Q78

A

1005-1678(2011)05-0341-04

2010-07-05

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(NO.2008AA10Z336)

田文靜，女，碩士研究生，主要從事基因工程藥物的研究開(kāi)發(fā);張同存，通信作者，Email:tony@tust.edu.cn;羅學(xué)剛，通信作者，Tel:022-60602099，Email:luoxuegang@tust.edu.cn。

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