八肽膽囊收縮素對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)膜電位的影響

石文艷，李麗，馬克濤，李新芝，張忠雙，司軍強(qiáng)

八肽膽囊收縮素對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)膜電位的影響

石文艷，李麗，馬克濤，李新芝，張忠雙，司軍強(qiáng)

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院／新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002）

八肽膽囊收縮素（CCK-8S）作為一種腦腸肽參與許多重要的生理和病理生理過(guò)程，為探討CCK-8S在痛覺(jué)信息傳遞中的作用，本研究應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)微電極記錄技術(shù)在急性分離的大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）上，觀察對(duì)DRG神經(jīng)元膜電位的影響。結(jié)果顯示：（1）灌流CCK-8S（10－8～10－6mol／L）可以使部分 DRG神經(jīng)元（25.2%，36／143）引起具有濃度依賴(lài)性的DRG神經(jīng)元去極化，EC50為1.7×10－7mol／L。（2）選擇性CCK-A受體拮抗劑prolu mide（10－4mol／L，n＝6）基本完全阻斷CCK-8S引起的去極化反應(yīng)，而 CCK-B受體拮抗劑 LY225910（10－4mol／L，n＝6）對(duì)CCK-8S介導(dǎo)的去極化則沒(méi)有影響。上述結(jié)果提示CCK-8S通過(guò)CCK-A受體引起濃度依賴(lài)的DRG神經(jīng)元去極化，參與痛覺(jué)信息傳遞或調(diào)節(jié)。

八肽膽囊收縮素；背根神經(jīng)節(jié)；細(xì)胞內(nèi)微電極記錄技術(shù)

膽囊收縮素（cholecystokinin，CCK）是一種腦腸肽，不僅存在于消化系統(tǒng)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)也有廣泛分布。CCK主要以硫酸化的八肽膽囊收縮素（sulfated cholecystokinin octapeptide，CCK-8S）作為活性成分發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。CCK-8S參與許多重要的生理和病理生理過(guò)程，如行為學(xué)、焦慮［1］、學(xué)習(xí)／記憶過(guò)程［2］、神經(jīng)源性痛［3］等。根據(jù) CCK 不同的藥理作用以及分子克隆技術(shù)可將CCK受體分為兩型，即CCK-A受體和CCK-B受體［4］。CCK-A受體主要分布在外周組織，如胃腸、胰腺、膽囊、幽門(mén)括約肌，亦存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的某些部位。CCK-B受體主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。背根神經(jīng)節(jié)（dorsal r oot ganglion，DRG）作為感覺(jué)信息傳入的第一級(jí)驛站，傳導(dǎo)來(lái)自軀體皮膚及深部組織的觸、壓、痛、溫覺(jué)及內(nèi)臟感覺(jué)的神經(jīng)元胞體所在部位。它是感覺(jué)沖動(dòng)由外周向中樞傳導(dǎo)的通路，在其傳入終末部位通過(guò)突觸前調(diào)制作用對(duì)初級(jí)感覺(jué)傳入信息實(shí)現(xiàn)初步的加工，因而在感覺(jué)信息的傳遞和調(diào)制中具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)微電極技術(shù)觀察CCK-8S對(duì)Wistar大鼠DRG神經(jīng)元膜電位的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物

出生后2～3周的幼年Wistar大鼠，雌雄不拘，由新疆地方病研究所動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供。動(dòng)物質(zhì)量符合一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

藥物用BSS液配制，通過(guò)開(kāi)關(guān)控制藥物灌流標(biāo)本，保持灌流速度、溫度和其它成分不變。所用藥物有：CCK-8S，LY 225910，prolumide由Sigma Research Biochemicals Inc.提供，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 電生理實(shí)驗(yàn)記錄

動(dòng)物在乙醚麻醉下行椎板切開(kāi)術(shù)，分離L4或L5DRG及與之相連的脊神經(jīng)背根，分離的離體標(biāo)本立即置于充氧的平衡鹽溶液（BSS）中。于體視顯微鏡下用游絲鑷清除DRG周?chē)慕Y(jié)締組織，然后將標(biāo)本用細(xì)鋼針固定于記錄浴槽（容積0.3 mL）底部之硅膠片上。BSS灌流速度為3～5 mL／min，灌流液溫度保持在25～30℃。BSS成分為：Na Cl 140 mmol／L；KCl 5 mmol／L；CaCl22 mmol／L；Mg Cl22 mmol／L；gl ucose 5 mmol／L；Tris 5 mmol／L；將p H調(diào)至7.4。記錄電極尖端直徑約為0.5μm，管內(nèi)充灌2 mol／L氯化鉀和1 mol／L醋酸鉀（KAc）混合液，微電極阻抗為15～30 MΩ。所記錄的電信號(hào)經(jīng)微電極放大器（MEZ28301，日本光電）放大和Powerlab數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以ˉX±S表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8S對(duì)DRG神經(jīng)元的膜電位的影響

預(yù)灌流CCK-8S可使部分DRG神經(jīng)元（25.2%，36／143）去極化，CCK-8S在DRG神經(jīng)元上引起去極化反應(yīng)有濃度依賴(lài)性。3×10－8、10－7、3×10－7和10－6mol／L的 CCK-8S分別引起幅度0.9±0.16 mV（n＝6）、3.5±0.08 mV（n＝4）、7.8±0.19 mV（n＝9）和10.9±0.34 mV（n＝5）。繪制量效曲線發(fā)現(xiàn)CCK-8S引起DRG神經(jīng)元去極化的EC50：1.7×10－7mol／L，Hill系數(shù)：1.75（圖1）。

圖1 CCK-8S引起DRG神經(jīng)元去極化的量效關(guān)系Fig.1 Concentration-dependent depolarization induced by CCK-8S on DRG neurones

2.2 CCK-8S通過(guò) CCK-A受體引起 DRG神經(jīng)元去極化

CCK-8S引起DRG神經(jīng)元去極化反應(yīng)由何種受體介導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)中預(yù)灌流選擇性CCK-A受體拮抗劑prol u mide和CCK-B受體拮抗劑LY225910，分別觀察其對(duì)CCK-8S引起DRG神經(jīng)元去極化的影響，10－4mol／L CCK-A受體拮抗劑prolu mide基本完全阻斷3×10－7mol／L的CCK-8S引起DRG神經(jīng)元去極化反應(yīng)（圖2a），反應(yīng)幅度從8.1±0.22 mV 降低到0.82±0.15 mV，見(jiàn)圖3，（n＝6，P＜0.01）。而 10－4mol／L CCK-B 受 體 拮 抗 劑LY225910對(duì)CCK-8S介導(dǎo)的去極化沒(méi)有影響（圖2b），反應(yīng)幅度從7.7±0.17 mV到7.6±0.31 mV，見(jiàn)圖3，（n＝6，P＞0.05）。

圖2 CCK-A和CCK-B受體阻斷劑對(duì)CCK-8S引起DRG神經(jīng)元去極化的影響Fig.2 Effects of CCK-AR and CCK-BR antagonists on the depolarization CCK-8S-induced

圖3 CCK-A和CCK-B受體阻斷劑對(duì)CCK-8S引起DRG神經(jīng)元去極化影響的柱狀圖Fig.3 Column graph presentation of the effects of CCK-AR and CCK-BR antagonists on the CCK-8S-induced depolarization

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在急性分離的Wistar大鼠DRG神經(jīng)元上發(fā)現(xiàn)CCK-8S通過(guò)CCK-A受體引起濃度依賴(lài)性的去極化反應(yīng)，但離子機(jī)制尚不清楚。有報(bào)道稱(chēng)CCK-8S可以激活小鼠大腦Orexin神經(jīng)元，引起內(nèi)向電流或去極化反應(yīng)，CCK-A受體阻斷劑lorglumide可以阻斷CCK-8S對(duì)Orexin神經(jīng)元的影響，與本研究結(jié)果一致。此外，非選擇型陽(yáng)離子通道阻斷劑SKF96365能顯著抑制CCK-8S引起的內(nèi)向電流，預(yù)灌流無(wú)Ca2＋溶液則顯著增強(qiáng)CCK-8S介導(dǎo)的內(nèi)向電流，提示Ca2＋敏感的陽(yáng)離子通道參與了CCK-8S引起的內(nèi)向電流或去極化反應(yīng)［5］。研究表明在黑質(zhì)的神經(jīng)元CCK-8S通過(guò)CCK-A受體引起去極化，此去極化反應(yīng)也是由非選擇性陽(yáng)離子通道介導(dǎo)，進(jìn)一步激活I(lǐng)P3-Ca2＋-Ca M依賴(lài)的蛋白激酶PKC系統(tǒng)后使胞內(nèi)多種底物蛋白質(zhì)磷酸化，發(fā)揮生理效應(yīng)［6］。也有報(bào)道稱(chēng)在SD大鼠的脊髓片上CCK-8S引起濃度依賴(lài)的去極化反應(yīng)，此去極化反應(yīng)可以被CCK-B受體阻斷劑L-365260所阻斷，且Na＋通道阻斷劑河豚毒素能夠顯著抑制CCK-8S引起的去極化反應(yīng)，提示在SD大鼠脊髓神經(jīng)元上CCK-8S引起的去極化反應(yīng)由Na＋通道介導(dǎo)［7］。為探討CCK-8S引起大鼠DRG膜去極化離子機(jī)制及CCK-A和CCK-B在DRG分布情況，將進(jìn)一步深入研究。

有實(shí)驗(yàn)表明，外周神經(jīng)的損傷可使初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元中內(nèi)源性CCK的含量增加［8］，通過(guò)初級(jí)傳入終末CCK的釋放，減弱內(nèi)源性和外源性阿片的鎮(zhèn)痛作用或使阿片的鎮(zhèn)痛作用失效。此外，前期的工作發(fā)現(xiàn)CCK-8S結(jié)合CCK-B受體進(jìn)一步激活細(xì)胞內(nèi)PLC-Ca2＋-PKC通路從而抑制 GABA-A 受體的功能。CCK-8S通過(guò)抑制由GABA介導(dǎo)的“突觸前抑制”從而增強(qiáng)初級(jí)感覺(jué)信息的傳遞（包括痛覺(jué)），參與脊髓水平初級(jí)感覺(jué)信息的調(diào)制［9］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CCK-8S通過(guò)CCK-A受體引起DRG神經(jīng)元去極化，使DRG神經(jīng)元膜電位距離閾電位絕對(duì)值減小，較小的傷害性刺激就可以引起DRG神經(jīng)元興奮，導(dǎo)致痛覺(jué)過(guò)敏或痛覺(jué)易化，從多方面參與神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)節(jié)。

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The Effect of CCK-8Son the Membrane Potential of Rat Dorsal Root Ganglion

SHI Wenyan，LI Li，MA Ketao，LI Xinzhi，ZHANG Zhongshuang，SI Junqiang
（Medical College of Shihezi University／Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases，Shihezi 832002，China）

The sulphated octapeptide fragment of cholecystokinin（CCK-8S）as a brain-gut peptide has been shown to be involved in nu merous physiological f unctions.To explore the role of CCK-8Sin trans mission of pain signal，Intracellular microelectrode recording technique was used to observe the effect of CCK-8Son the membrane potential of neuron acutely isolated in rat dorsal root ganglia（DRG）.Results as follow：（1）CCK-8S（10－8～10－6mol／L）could depolarize the neur ons of DRG（25.2%，36／143）in a concentration-dependent way，and EC50was 1.7×10－7mol／L.（2）The membrane depolarization induced by CCK-8S was abolished by prolu mide（10－4mol／L），a selective antagonist of CCK-AR（n＝6），but not by LY225910（10－4mol／L），a selective antagonist of CCK-BR （n＝6）.These results suggest that CCK-8Scauses concentration-dependent depolarization of neuron in DRG through CCK-A receptor，involved in trans mission of pain signal.

CCK-8S；DRG；intracellular micr oelectrode recording technique

R338.8

A

1007-7383（2011）04-0483-03

2011-04-22

新疆兵團(tuán)青年科技創(chuàng)新資金項(xiàng)目（2010JC33），石河子大學(xué)高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（RCZX200676）作者簡(jiǎn)介：石文艷（1977-），女，講師，從事神經(jīng)電生理學(xué)研究。

司軍強(qiáng)（1965-），男，教授，從事神經(jīng)和血管電生理學(xué)研究；e-mail：sijunqiang11＠hot mail.com。