高產(chǎn)乙酸乙酯畢赤酵母篩選及其耐受性能研究

李 群，林 斌，柯 鋒，樂細選，楊 強，楊生智，陳申習(xí)

（勁牌有限公司勁牌研究院中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室，湖北大冶 435100）

乙酸乙酯是清香型白酒中的主體香味成分，其含量的高低直接影響白酒風(fēng)格和品質(zhì)[1-2]，在清香型小曲白酒中，較高的乙酸乙酯含量可使酒的香味更加醇和濃郁。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在清香小曲白酒實際釀造過程中，乙酸乙酯主要是通過微生物代謝底物產(chǎn)生的，產(chǎn)酯酵母在其中扮演了重要角色[3]。目前在提高清香型小曲白酒中乙酸乙酯含量方面雖取得了一定研究成果，但尚未達到理想的含量，清香型小曲白酒質(zhì)量仍有很大的提升空間[4]。

據(jù)文獻報道，產(chǎn)酯能力較強的酵母包括畢赤酵母屬（Pichia）、漢遜酵母屬（Hansenula）、假絲酵母屬（Candida）等。近年來，對產(chǎn)酯酵母研究最多是球擬酵母（Torulopsis）、漢遜酵母（Hansenula）和假絲酵母（Candida）[5-6]。在清香型小曲白酒釀造中，畢赤酵母屬中一些優(yōu)勢酵母種類如庫德里阿茲威畢赤酵母、發(fā)酵畢赤酵母、膜璞畢赤酵母、異常畢赤酵母等，可代謝多種酯類物質(zhì)，在釀酒行業(yè)具有極大的研究價值和應(yīng)用潛力。庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），對釀造環(huán)境的適應(yīng)性好，對溫度、乙醇、酸度的耐受性強，可代謝產(chǎn)生乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯等多種酯類物質(zhì)[7]。王勇[8]從牛欄山二鍋頭酒醅中篩選得到120株酵母菌，對不同酵母發(fā)酵代謝產(chǎn)物進行分析，發(fā)現(xiàn)庫德里阿茲威畢赤酵母具有較高產(chǎn)乙酸乙酯能力。膜璞畢赤酵母（Pichia Membranifaciens）能產(chǎn)生β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和一些揮發(fā)性酚類物質(zhì)，如4-乙基苯酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚[9-10]，可以增加原酒的香氣。姚翠萍等[11]對膜璞畢赤酵母發(fā)酵代謝產(chǎn)物進行分析，發(fā)現(xiàn)該菌主要產(chǎn)物為酸、醇、酯以及一些特殊呈香物質(zhì)，其中，苯乙醇、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸等含量較為豐富，并能產(chǎn)生降低膽固醇和血脂的活性成分亞油酸乙酯。異常畢赤酵母（Pichia anomala），現(xiàn)名異常威克漢遜酵母（Wickerhamomyces anomalus），是白酒中普遍存在的菌種，能高產(chǎn)乙酸乙酯[12]，耐受低pH、低水活度、高滲透壓、厭氧等極端環(huán)境。張杰等[13]從清香型小曲白酒發(fā)酵酒醅中篩選出一種高產(chǎn)乙酸乙酯的異常畢赤酵母，添加該菌株釀造的清香型白酒中乙酸乙酯含量為2.86 g/L，是對照組白酒中乙酸乙酯含量的1.5 倍。發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）高產(chǎn)酯酶，具有較高C4—C8酯酶活性，可增加葡萄酒香味[14]。

隨著食品生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的功能微生物正在改變釀酒方式，通過篩選功能菌株添加到釀造中是一種有效提升白酒品質(zhì)的方法。鑒于畢赤酵母在清香型小曲白酒發(fā)酵中具有較多的種類，但其不同種類及不同株在釀造中的作用尚未研究清晰，結(jié)合清香型小曲白酒品質(zhì)提升需求，本文旨在通過對菌種庫不同種畢赤酵母進行產(chǎn)酯篩選和釀造特性研究，以期篩選出性能優(yōu)良菌株，將其應(yīng)用于清香型小曲白酒生產(chǎn)中，以期提高酒曲及其釀造質(zhì)量，改善小曲白酒品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌種信息

所有菌株均為實驗室菌種庫保藏菌株，分離自勁牌有限公司酒曲、釀造酒醅，詳細信息如表1所示。

表1 45株畢赤酵母菌株信息

1.1.2 儀器與試劑

試劑：葡萄糖、溴甲酚紫、三丁酸甘油酯、硫酸銨、尿素、磷酸二氫銨、硫酸鎂，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；β-淀粉酶（酶活50 000 U/g）、糖化酶（酶活100 000 U/g），無錫雪梅酶制劑科技有限公司；蛋白胨、瓊脂粉，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；乙醛、甲醇、正丙醇、乙酸乙酯等標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純），中國醫(yī)藥集團有限公司。

儀器設(shè)備：QHZ-98A 全溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉市華美生化儀器廠；5424 R 離心機，Eppendorf 公司；WFJ 2000 可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；JJ6000 電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；MJ-250BSH-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-CJ-1B 凈化工作臺，蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；YXQ-LS-75SII 高壓滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；7890A 氣相色譜儀，美國Agilent 公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD 液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L，水1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。

產(chǎn)酯固體培養(yǎng)基：溴甲酚紫0.04 g/L，三丁酸甘油脂15 mL/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，121 ℃高壓滅菌20 min。

高粱汁培養(yǎng)基：1000 g 高粱磨粉，加入5 L 溫水，加入5 g 糖化酶、5 g α-淀粉酶，攪拌后放入60 ℃烘箱中保溫30 min，后于105 ℃，30 min 高壓蒸煮，待冷卻至60 ℃，將團塊捏碎，再加入5 g 糖化酶、5 g β-淀粉酶，放入60 ℃烘箱中糖化24 h，過濾得濾液，測定糖度，冷凍保藏備用。

酵母麩皮種培養(yǎng)基：麩皮1（以1計），硫酸銨5‰，葡萄糖4%，水60%，于121°C 濕熱滅菌20 min。

酵母培養(yǎng)基：稱取糖蜜，加入2 倍體積（按糖蜜重量計）的85 ℃熱水，攪拌至糖蜜溶解得到溶液，再加入溶液體積0.1%的濃硫酸，攪勻靜置12 h，將上層清液加至發(fā)酵罐中，并補水至糖蜜培養(yǎng)基的糖度為12 °Bx；按質(zhì)量比為2 ‰、1 ‰、1 ‰、1 ‰、2‰、10%稱取硫酸銨、尿素、磷酸二氫銨、硫酸鎂、酵母浸粉和消泡劑并倒入發(fā)酵罐中，加水至罐容積的70 %，開啟攪拌使?fàn)I養(yǎng)鹽完全溶解，滅菌冷卻，即得酵母培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化

從菌種庫中挑選不同種類畢赤酵母，取甘油保藏管中100 μL 菌液移入到10 mL YPD 液體管中，于30 ℃、150 r/min 搖床中培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)沾取培養(yǎng)液在YPD 平板上進行劃線分離，30 ℃倒置培養(yǎng)48 h，取一環(huán)單菌落接種于YPD 液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min 搖床中培養(yǎng)24 h 得種子液，放冰箱冷藏備用。

1.2.2 產(chǎn)酯菌株初篩

取一環(huán)待測酵母菌株種子液于產(chǎn)酯培養(yǎng)基進行平板劃線，培養(yǎng)48 h，觀察其菌落顏色。菌株產(chǎn)酯能力不同呈現(xiàn)在產(chǎn)酯平板上的菌落顏色也不相同，菌落黃色越濃，表明菌株的產(chǎn)酯量越多[15]。

1.2.3 產(chǎn)酯菌株復(fù)篩

將高粱汁培養(yǎng)基加水調(diào)節(jié)糖度為10°Bx，分裝50 mL 至250 mL 錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min。取活化后的種子液按1%（v/v）的接種量接入培養(yǎng)基中，裝上發(fā)酵栓，稱重，精確至0.01 g，于30 ℃靜置發(fā)酵7 d。發(fā)酵結(jié)束后取5 mL 發(fā)酵液，8000 r/min離心5 min，取上清液，過0.45 μm濾膜，過濾好的發(fā)酵上清液進行氣相色譜分析。

1.2.4 酵母麩皮種制備

將待測菌株種子液按2 %（v/v）的接種量接入YPD 液體培養(yǎng)基中，于30 ℃搖床培養(yǎng)24 h。將液體種按40%（麩皮濕重計）的接種量接種于酵母麩皮培養(yǎng)基中，于30 ℃靜置培養(yǎng)48 h 后放于30 ℃烘箱烘干，通過血球計數(shù)板計數(shù)法得知所有固體種酵母數(shù)量均達到108CFU/g。將測試菌株固體種與桂花曲按照1∶19（m/m）配比成試驗混合曲。

1.2.5 酵母麩皮種擴大培養(yǎng)

按照1 g/100 mL 的比例稱取麥芽浸粉，用水溶解后，分裝至1000 mL 的三角瓶中，每瓶裝液量500 mL，滅菌備用；將酵母種試管純培養(yǎng)物接入三角瓶中，30 ℃下140 r/min 搖床培養(yǎng)24 h；將培養(yǎng)好的三角瓶接入裝有1.1.3 制備的酵母培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)22 h，然后使用圓盤制曲機生產(chǎn)。將發(fā)酵罐中菌種液接種到經(jīng)過滅菌的麩皮培養(yǎng)基中，啟動溫控系統(tǒng)自動控制圓盤溫度在30～32 ℃之間，培養(yǎng)32 h 后，出盤干燥，粉碎，檢測細胞數(shù)大于10×108CFU/g 為合格。將酵母純種制劑與公司桂花曲按照1∶19（m/m）比例配成混合曲備用。

圖像識別技術(shù)是以提取拉鉚銷位置周圍圖像的主要特征為基礎(chǔ)，并將待識別圖像與圖像庫的有限特征參數(shù)進行匹配，從而達到鉚接位置識別的目的。計算機圖像識別分為離線訓(xùn)練和在線識別兩個步驟，每個步驟分別設(shè)計了相應(yīng)的應(yīng)用程序。程序核心是BP(back propagation)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法。其中圖像特征提取及離線訓(xùn)練方法直接決定了圖像識別的準(zhǔn)確性。鉚接位置識別程序系統(tǒng)框圖如圖2所示。

1.2.6 固態(tài)小試試驗

糯高粱經(jīng)65 ℃水浸泡24 h，浸泡好的糧食放入滅菌鍋中進行初蒸（115 ℃，10 min）、燜糧（100 ℃，5 min）、復(fù)蒸（111 ℃，10 min）。將復(fù)蒸好的糧食冷卻至30 ℃，分裝進12 號自封袋中，每袋1.05 kg，按干糧重1%的下曲量加入1.2.4 中所制備的混合酒曲，將曲與糧食攪拌均勻，放入培養(yǎng)箱在30 ℃下開口糖化24 h。糖化完成后，按照單個樣品500 g 的量稱取酒糟，將糖化好的糧食與酒糟按質(zhì)量比為1∶1 進行混合，混勻后裝入氣體采樣袋，密封，抽真空，放入培養(yǎng)箱于30 ℃發(fā)酵7 d，7 d 后將發(fā)酵好的酒醅裝入特制三角燒瓶中進行蒸餾，取前100 mL酒樣進行色譜檢測。

1.2.7 中試生產(chǎn)試驗[5，16]

按清香型小曲白酒車間生產(chǎn)工藝進行中試生產(chǎn)。糯高粱經(jīng)75℃水浸泡20 h 后，經(jīng)過初蒸、燜糧和復(fù)蒸得到熟糧，攤晾后下曲（1%），分別接種對照桂花曲和1.2.5 中所制備的混合曲，將曲與糧食攪拌均勻后送至糖化箱場進行培菌糖化，糖化22 h。按照車間生產(chǎn)比例添加配糟，混勻后發(fā)酵周期為14 d，發(fā)酵結(jié)束后蒸餾即得小曲原酒，取100 mL 原酒進行氣相色譜檢測揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

1.2.8 氣相色譜數(shù)據(jù)檢測

準(zhǔn)確移取1 mL酒樣于2 mL樣品瓶中，加入10 μL三內(nèi)標(biāo)使用液（叔戊醇(IS1)：17028.1 mg/L，乙酸正 戊 酯(IS2)：16864 mg/L，2-乙 基 己 醇(IS3)：12104.2 mg/L），蓋上瓶蓋，搖勻，采用氣相色譜法測定原酒中各成分含量。色譜條件為：Agilent 7890A氣相色譜儀，檢測器FID，CP WAX 毛細管色譜柱（50 m*0.2 μm*0.25 mm）；升溫程序：柱溫40 ℃保持8 min，以5 ℃/min 升至150 ℃；進 樣口溫度250 ℃，檢測器溫度260 ℃，空氣、氫氣流速比300∶30，載氣為氮氣，分流比30∶1，柱流量1.0 mL/min；進樣方式：自動進樣。

1.2.9 菌株耐受性分析[17]

1.2.10 數(shù)據(jù)處理

使用origin 2016對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酯酵母篩選

2.1.1 產(chǎn)酯酵母初篩

使用產(chǎn)酯固體培養(yǎng)基對所挑選菌株（編號1—45，其中11 號菌株未成功活化）進行了產(chǎn)酯初篩，結(jié)果如表2 所示，外島畢赤酵母（14、15）、發(fā)酵畢赤酵母（26）、盔形畢赤酵母（40）、伯頓絲孢畢赤酵母（43）菌落為深黃色，表明產(chǎn)酯強；發(fā)酵畢赤（27、28）、盔形畢赤（32、39）菌落為黃色，表明產(chǎn)酯較強；盔型畢赤酵母（34）伯頓絲孢畢赤酵母（44）菌落為紫色，表明不產(chǎn)酯；其余菌株菌落為淺黃色，表明產(chǎn)酯較弱。

表2 產(chǎn)酯特性篩選結(jié)果

2.1.2 產(chǎn)酯酵母液態(tài)發(fā)酵復(fù)篩

對產(chǎn)酯初篩平板上顯示為淺黃色、黃色和深黃色菌株均進行了液態(tài)發(fā)酵復(fù)篩。如表3 所示，7 號（Y42）和6 號（Y14）具有最高乙酸乙酯含量，分別為2.81 g/L 和2.67 g/L，24 號（J32）為1.03 g/L,5 號（Y87）為1.00 g/L,4 號（Y10）為0.52 g/L。挑選該5株菌進行后續(xù)研究。

表3 不同畢赤酵母液態(tài)發(fā)酵特征

2.2 產(chǎn)酯畢赤酵母實驗室固態(tài)實驗

為進一步驗證復(fù)篩產(chǎn)酯酵母菌株對清香型小曲白酒風(fēng)味影響，對液態(tài)復(fù)篩選出的5 株酵母，分別為費比恩畢赤酵母（Y10）、異常威克漢遜酵母（Y87、Y14、Y42）和庫德里阿茲威畢赤酵母（J32），進行實驗室固態(tài)釀造實驗，實驗結(jié)果如表4 所示。與對照桂花曲相比，Y10 菌株出酒率有一定提高，增加2.6 %，其他菌株無顯著差異；乙醛含量方面，除J32 外，其他菌株相對于桂花曲均有不同程度降低，其中Y87 下降幅度最大，達到54.39 %；甲醇和正丙醇含量與桂花曲相比無明顯差異；乙酸乙酯含量方面，除J32 菌株低于對照組外，其余菌株均有不同程度提高，Y10 菌株產(chǎn)乙酸乙酯含量提升最高，達到57.1%；雜醇油含量方面，Y10 菌株低于對照6.5 %，其他菌株與對照無明顯差異。綜合分析表明菌株Y10 在乙酸乙酯提升方面具有明顯的效果。

表4 5株畢赤酵母實驗室固態(tài)釀造結(jié)果

2.3 產(chǎn)酯畢赤酵母中試車間應(yīng)用研究

為進一步驗證畢赤酵母Y10 在清香型白酒中試生產(chǎn)中的應(yīng)用效果，將Y10 擴大培養(yǎng)制曲，按比例添加至桂花曲中進行發(fā)酵，以不添加的桂花曲為對照，每次投糧量1850 kg，連續(xù)投料9 批，發(fā)酵14 d，結(jié)果如表5 所示。與桂花曲相比，Y10 發(fā)酵出酒率相當(dāng)；色譜數(shù)據(jù)方面，Y10 釀造原酒中乙醛含量提高了12.2 %，甲醇、正丙醇含量均與桂花曲無差異；乙酸乙酯方面，Y10 平均提升了13.7%；雜醇油方面，降低了2.3%。

表5 畢赤酵母Y10中試生產(chǎn)數(shù)據(jù)結(jié)果

2.4 產(chǎn)酯畢赤酵母耐受性分析

白酒發(fā)酵過程相對復(fù)雜，高溫、高糖、高酒精、高滲透壓等環(huán)境對菌株生長提出了較高的要求[18]。因此能應(yīng)用于生產(chǎn)中的菌株需滿足一定的生理特性要求，為此對獲得的菌株開展環(huán)境耐受性研究。

以公司桂花曲中產(chǎn)香酵母Y29 為對照菌株，對產(chǎn)酯畢赤酵母Y10 進行了環(huán)境耐受性分析。結(jié)果顯示，隨著葡萄糖含量增加，酵母生物量隨之降低，Y10 和Y29 菌株最高可耐受500 g/L 的葡萄糖濃度如圖1（A）所示。由于發(fā)酵過程產(chǎn)生的高濃度乙醇會給酵母細胞代謝帶來毒害，使酵母停滯生長或死亡，從圖1（B）可知，隨著乙醇含量的增加，菌株生長受到抑制，Y10 和Y29 可耐受6 %的乙醇含量，隨后隨著乙醇含量增加，菌株生物量顯著下降。發(fā)酵后期酒醅中乙醇濃度不超過6 %，因此Y10酵母能夠耐受發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙醇濃度。

發(fā)酵過程中高濃度的酸類物質(zhì)會降低酵母細胞的代謝速率，抑制或殺死細胞，從而影響發(fā)酵能力。如圖1(C)所示，隨著pH 值降低，酵母生物量隨之降低，但兩株菌在pH 值高于3.0 的條件下均能較好生長。酒醅發(fā)酵過程pH 值為4 左右，因此Y10酵母能夠適應(yīng)酒醅的酸性環(huán)境。

溫度是影響酵母生長繁殖的關(guān)鍵因素之一，由圖1(D)可知，當(dāng)溫度超過37 ℃，菌株生物量均顯著下降，在45 ℃的高溫環(huán)境下幾乎無生長，其中Y29在30 ℃有最高生物量，Y10在37 ℃有最高生物量，表明Y10菌株對高溫環(huán)境具有較好耐受性。如圖1(E)所示，Y29 和Y10 最高可耐受8%的NaCl 濃度，當(dāng)NaCl 濃度超過8%時，酵母生長受到抑制，菌株生物量急劇下降。

圖1 不同條件下酵母菌株生長情況

3 結(jié)論

通過產(chǎn)酯顯色培養(yǎng)基初篩和液態(tài)發(fā)酵復(fù)篩，從公司清香型白酒菌種庫挑選的45 株不同畢赤酵母中獲得了5 株產(chǎn)乙酸乙酯較高的畢赤酵母。經(jīng)實驗室固態(tài)發(fā)酵驗證，Y10 菌株具有最高乙酸乙酯含量，為1.21 g/L，相較于對照桂花曲提升57.1%。將Y10 擴大培養(yǎng)制曲應(yīng)用于清香型白酒中試車間進行釀造，生產(chǎn)原酒中乙酸乙酯含量比對照提升了13.7%。對Y10 耐受性進行分析，該菌株能分別耐受500 g/L葡萄糖、6%乙醇、pH3.0、37 ℃和8%Na-Cl條件，滿足清香型小曲白酒的發(fā)酵條件。經(jīng)文獻查閱，菌株Y10 為首次在清香型小曲白酒中開展提酯應(yīng)用研究的費比恩畢赤酵母，能較好地改善原酒品質(zhì)，具有較高的應(yīng)用價值，進一步豐富了清香型小曲白酒功能菌資源。