Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在BHK細(xì)胞表達(dá)鼠IL-2蛋白的研究*

黃大林 戴支凱 王 鑫 李彬彬 鐘 江

Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在BHK細(xì)胞表達(dá)鼠IL-2蛋白的研究*

黃大林 戴支凱 王 鑫 李彬彬 鐘 江△

目的：利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在BHK細(xì)胞表達(dá)重組鼠白細(xì)胞介素（IL）-2蛋白。方法：用Flag標(biāo)記鼠IL-2并加入真核細(xì)胞啟動(dòng)子CMV，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFB-CMV-IL-2并予酶切和PCR鑒定；將鼠IL-2克隆入桿狀病毒表達(dá)載體pFastBacDual中，將pFB-CMV-IL-2轉(zhuǎn)化到含桿狀病毒穿梭載體Bacmid的DH10Bac感受態(tài)菌中，篩選陽性克隆，獲得重組桿狀病毒載體Bacmid-pFB-CMV-IL-2，抽提質(zhì)粒；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將Bacmid-pFB-CMV-IL-2轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞包裝病毒，收獲重組桿狀病毒，將構(gòu)建病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK細(xì)胞培養(yǎng)，用Western blot檢測IL-2蛋白。結(jié)果：通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，在BHK細(xì)胞成功表達(dá)重組的鼠IL-2蛋白。結(jié)論：重組桿狀病毒在真核細(xì)胞中成功表達(dá)重組鼠IL-2蛋白。

白細(xì)胞介素2 重組蛋白質(zhì)類 桿狀病毒科 遺傳載體 質(zhì)粒 聚合酶鏈反應(yīng) 小鼠,近交系

20世紀(jì)90年代出現(xiàn)的Bac-to-Bac商業(yè)化系統(tǒng)，成功地將桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)變?yōu)榫哂袕V泛用途的系統(tǒng)，通過這個(gè)系統(tǒng)將外源基因定向重組克隆到桿狀病毒基因組上多角體啟動(dòng)子后，成功構(gòu)建桿狀病毒的穿梭質(zhì)粒。提取穿梭質(zhì)粒，即病毒基因組提取出來，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞就可以得到重組病毒。隨著Bac-to-Bac應(yīng)用范圍越來越廣，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出一系列用于定向轉(zhuǎn)座的供體質(zhì)粒，甚至能利用桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)多個(gè)蛋白。迄今已經(jīng)成功表達(dá)了許多外源基因，例如雞胃酶解肌球蛋白[1]、視紫質(zhì)激酶[2]、人類干擾素-β[3]等。筆者使用Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建鼠白細(xì)胞介素-2（IL-2）基因桿狀病毒表達(dá)載體并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)重組構(gòu)建鼠IL-2蛋白，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌種和質(zhì)粒 大腸桿菌JF1125；昆蟲細(xì)胞草地夜蛾（Spodoptera frugierda）卵巢組織細(xì)胞系Sf9，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）；pFastBacDual質(zhì)粒，pFastTATBacDu?al質(zhì)粒及T-CMVp，幼倉鼠腎細(xì)胞（BHK）等由復(fù)旦大學(xué)微生物學(xué)與微生物工程系鐘江課題組實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.2 試劑與儀器 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和堿性磷酸酶購自TaKaRa大連寶生物工程公司；TNM-FH培養(yǎng)液由購自Sigma公司的粉劑配制，加10%的小牛血清使用。轉(zhuǎn)染試劑CellFectin購自Invitrogen公司；RMPI 1640培養(yǎng)液購自杭州吉諾公司；DNA凝膠回收試劑盒以及PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自上海杰瑞生物科技有限公司；細(xì)胞總RNA抽提試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司。λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ購自MBI Fermentas公司，DL2000購自物TaKaRa公司，RNase A購自上海華舜生物工程有限公司；預(yù)染蛋白Marker（mid）購自北京鼎國昌盛生物公司；Taq DNA polymerase購自北京天根公司；蛋白酶K購自Roche公司；F-7425 Anti-Flag和羊抗兔IgG抗體購自Sigma公司。GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱；HZ-9211K恒溫細(xì)菌培養(yǎng)搖床；81-2型恒溫磁力攪拌器，DK-8D型電熱恒溫水槽；無菌操作臺(tái)；Eppendorf臺(tái)式高速離心機(jī)（Centrifige 5415D）；PCR儀（Thermo Life Science）；YLN-2000 DNA 凝膠成像儀；DYY-2C型DNA電泳儀；BIO-RAD POWER PAC3000蛋白電泳儀；Nikon倒置顯微鏡（FX35A）；SHP-150型生化培養(yǎng)箱，Thermo Scientific Series CO2培養(yǎng)箱。

1.3 方法

1.3.1 小鼠IL-2基因的獲得及鑒定 采用SPF級40日齡的昆明小鼠購自復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，平均體質(zhì)量為(22.08±3.00)g。拉頸處死小鼠，打開腹腔，無菌取出小鼠脾臟，使用100目細(xì)胞篩網(wǎng)制備脾細(xì)胞懸液，采用淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞。將鼠脾淋巴細(xì)胞在刀豆球蛋白A（Con A）的刺激下體外培養(yǎng)72 h后，提取激活淋巴細(xì)胞總RNA；參照GenBank鼠IL-2 cDNA基因序列設(shè)計(jì)一對引物，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。IL-2引物上游-ATATCTAGAATACAGCAGCATGCAGCTCGC-，下游-TCTGCTACCTTAGTCGTCGTGGTCTTTGTAGTCTTGAGG GCTTTTGAGATG-，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定。

1.3.2 重組含有小鼠IL-2基因質(zhì)粒載體 用XbaⅠ/KpnⅠ雙酶分別酶切pFastBac Dual質(zhì)粒和IL-2的PCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳割膠回收DNA，分別作為載體和供體片段，通過T4連接酶連接得到pFB-IL-2，經(jīng)過轉(zhuǎn)化大腸桿菌JF1125得到pFB-IL2質(zhì)粒，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR鑒定。

1.3.3 載體加入真核細(xì)胞啟動(dòng)子CMV 用EcoRⅠ酶切pFB-IL-2（需CIAP去磷酸化處理）和T-CMVp上切下CMV啟動(dòng)子片段，分別作為載體和供體片段，通過T4連接酶在16℃連接12 h,將CMV啟動(dòng)子插入pFB-IL-2的EcoRⅠ位點(diǎn)，經(jīng)過轉(zhuǎn)化大腸桿菌JF1125得到pFB-CMV-IL-2質(zhì)粒，提取質(zhì)粒DNA。

1.3.4 重組小鼠IL-2基因質(zhì)粒載體的酶切鑒定和序列分析驗(yàn)證 pFB-CMV-IL-2質(zhì)粒用KpnⅠ、XbaⅠ和BglⅡ分別進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果正確后將構(gòu)建的pFB-CMV-IL-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JF1125，將菌液進(jìn)行質(zhì)粒序列分析測定（上海博尚生物公司）。

1.3.5 重組Bacmid-pFB-CMV-IL-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞 利用Invitrogen公司的產(chǎn)品Bac-to-Bac系統(tǒng)來構(gòu)建重組桿狀病毒，挑取轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞生長的白色菌落，提取Bacmid，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將Bacmid-pFB-CMV-IL-2轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞包裝病毒，Sf9細(xì)胞培養(yǎng)于FH10培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d，離心后收獲上清，即獲取完整重組桿狀病毒，反復(fù)感染Sf9細(xì)胞擴(kuò)增病毒。提取病毒基因組，用PCR驗(yàn)證重組桿狀病毒的正確性。

1.3.6 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK細(xì)胞 將24孔板中每孔接種大約1.5×105個(gè)BHK細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞過夜，貼壁后加入適量病毒液使感染復(fù)數(shù)（MOI）約為5 pfu/cell，37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，病毒感染72 h后收獲細(xì)胞。

1.3.7 SDS-PAGE電泳和Western blot檢測重組的IL-2蛋白 用胰酶消化BHK細(xì)胞后，將細(xì)胞吹打下來，5 000 r/min離心5 min。棄上清，加入50 μL 2×SDS 樣品緩沖液，100 ℃煮沸5 min。樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，使用預(yù)染蛋白Marker，電泳后將PAGE膠剝離，放入NC膜轉(zhuǎn)移裝置中進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，將電泳槽置于裝滿冰塊盆中，恒流200 mA，電泳2 h；電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出轉(zhuǎn)移NC膜，一抗用兔源F-7425 An?ti-Flag克隆抗體，二抗為羊抗兔IgG抗體，在10 mL AP底物緩沖液中加入BCIP 33 μL、NBT 66 μL，將NC膜放入，進(jìn)行顯色反應(yīng)，直到出現(xiàn)清晰的條帶，膜干燥后，拍照后用塑料袋封存。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為600 bp，與陽性對照IL-2吻合，見圖1。

2.2 PCR鑒定pFB-IL-2質(zhì)粒結(jié)果 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為600 bp，與陽性對照IL-2吻合，見圖2。

2.3 酶切pFB-CMV-IL-2質(zhì)粒結(jié)果 用KpnⅠ酶切PFB-CMV-IL-2分別得到0.5、0.7和4.7 kb共3個(gè)片段；用XbaⅠ酶切得到0.7和5.2 kb片段；用BglⅡ酶切得到0.5、1.8和3.6 kb共3個(gè)片段，與預(yù)期結(jié)果吻合，見圖3。

2.4 測序結(jié)果 將菌液測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行檢索，利用Blast軟件在GenBank進(jìn)行序列比對，與GenBank鼠IL-2相吻合，成功構(gòu)建含鼠IL-2的載體質(zhì)粒，測序驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果正確。

2.5 重組桿狀病毒穿梭載體的PCR驗(yàn)證 提取病毒DNA基因組，用IL-2特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,成功擴(kuò)出了1條約600 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，見圖4。

2.6 Western blot結(jié)果分析 在50 ku之間有一條帶,表明重組桿狀病毒感染的BHK細(xì)胞表達(dá)了與抗單克隆抗體特異性結(jié)合的蛋白,即IL-2，見圖5。

3 討論

與其他病毒載體系統(tǒng)相比較，重組桿狀病毒構(gòu)建方便，而且易于擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模及得到高滴度的病毒；桿狀病毒的基因組和棒狀的核衣殼可以容納100多kb的DNA，最大可插入約40 kb的外源基因；能轉(zhuǎn)染末端分化細(xì)胞和原代培養(yǎng)細(xì)胞；以高感染復(fù)數(shù)感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)也沒有細(xì)胞毒性；安全性好，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)不會(huì)整合到基因組中，不能復(fù)制，自身啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)也沒有活性。以上優(yōu)點(diǎn)使得桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有廣泛應(yīng)用性。自1983年Smith[3]首次利用AcNPV表達(dá)成功人干擾素-β以來，現(xiàn)估計(jì)有近千種外源基因在桿狀病毒表達(dá)載體中得到表達(dá)。桿狀病毒可以作為一種新型的基因表達(dá)載體將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，因此，重組桿狀病毒已被廣泛應(yīng)用于基因工程[4]、疫苗開發(fā)[5]、基因治療[6]等眾多領(lǐng)域中。

IL-2是主要由激活T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類Th1型細(xì)胞因子，它能夠有效地提高機(jī)體的免疫功能，促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等的殺傷活性；能激活和提高免疫細(xì)胞的多種功能，提高其殺傷癌細(xì)胞、病毒或細(xì)菌感染細(xì)胞、促進(jìn)抗體生成和分泌的能力，在抗腫瘤、抗毒素、免疫調(diào)節(jié)及治療感染性疾病中具有重要作用[7]。自Taniguchi等[8]從人體細(xì)胞中首次克隆出IL-2全長cDNA并報(bào)道其全序列以來，已從30多種動(dòng)物中克隆出此基因，重組IL-2還在提高機(jī)體免疫力、抗感染和癌癥治療等方面獲得了廣泛的應(yīng)用[9]。

本研究通過RT-PCR擴(kuò)增出鼠IL-2基因，用Flag對IL-2進(jìn)行標(biāo)記，通過構(gòu)建鼠IL-2的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，通過克隆將其插入pFastBacDual和pFastBacDu?alTAT，成功構(gòu)建了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移載體pFB-CMV-IL2質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得含IL-2的重組桿狀病毒，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK細(xì)胞成功表達(dá)IL-2蛋白，為進(jìn)一步研究該重組蛋白的生物學(xué)活性、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等奠定了良好的基礎(chǔ)，亦為其他蛋白質(zhì)的真核表達(dá)提供了方法學(xué)的參考。

致謝：感謝復(fù)旦大學(xué)微生物系鐘江教授提供資助。

[1]Onishi H,Maeda K,Maeda Y,et al.Functional Chicken Gizzard Heavy Meromyosin Expression in and Purification from Baculovi?rus-Infected Insect Cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，1995,92（3）:704-708.

[2]Cha K,Bruel C,Inglese J,et al.Rhodopsin kinase Expression in bac?ulovirus-infected insect cells,and characterization of post-transla?tional modifications[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997,94（5）:10577-10582.

[3]Smith MD.Production of human beta interferon in insect cell infect?ed with baculovirus express vectors[J].Mol Cell Biol，1983,3（2）:2156-2165.

[4]Ames RS,Formwald JA,Nuthulaganti P,et al.BacMam recombinant baculoviruses in G protein-coupled receptor drug discovery[J].Re?ceptors Channels,2004,10（3）:99-107.

[5]Abe T,Takahashi H,Hamazaki H,et al.Baculovirus Induces an in?nate immune respones and confers protection from lethal influenza virus infection in mice[J].J Immunol,2003,171（3）:1133-1139.

[6]Wang CY,Li F,Yang Y,et al.Recombinat baculovirus containing the diphtheria toxin a gene for malignant glioma therapy[J].Cance Res,2006,66（11）:5798-5580.

[7]Kogut MH,Roothwell L,Kacser P.Differential effect of age on chick?en heterophil futional activation by recombinant chicken interleu?kin-2[J].Dev Comp Immunol,2002,26（9）:817-830.

[8]Taniguchi T,Matsui H,Fujita T,et al.Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2[J].Nature,1983,302（5906）:305-310.

[9]Zelus D,Robinson RM,Delacre M,et al.Fast evolution of interleu?kin-2 in mammals and positive in ruminants[J].J Mol Evol,2000,51（3）:234-244.

Bac-to-Bac Baculovirus Expression System in IL-2 Protein of BHK

HUANG Dalin,DAI Zhikai,WANG Xin,LI Binbin,ZHONG Jiang

Guilin Medical University,Guangxi 541004,China

Objective：To construct recombinant mouse IL-2 protein in BHK cells using Bac-to-Bac baculovirus expres?sion system.Methods：The mouse IL-2 was marked by Flag，and joined the eukaryotic cell promoter CMV.The plasmid pFB-CMV-IL-2 was constructed to recombinant,restriction enzyme was used to digest,and was amplified by PCR.The mouse IL-2 was cloned into the baculovirus expression vector pFastBacDual and pFB-CMV-IL-2 was transformed into bacu?lovirus shuttle vector containing the DH10Bac competent bacmid bacteria.The clones were recombinant baculovirus vector Bacmid-pFB-CMV-IL-2,extracted plasmid with liposome transfection method Bacmid-pFB-CMV-IL-2 transfected Sf9 in?sect cells packaging the virus,harvested recombinant baculovirus.A virus transduction of BHK cell culture was built using Western blot to detect the IL-2 protein.Results:By baculovirus expression system,mouse recombinant IL-2 protein was successfully expressed in BHK cells.Conclusion:Recombinant baculovirus was successfully expressed mouse IL-2 protein in eukaryotic cells.

interleukin-2 recombinant proteins baculoviridae genetic vectors plasmids polymerase chain re?action mice,inbred strains

*國家科技攻關(guān)863資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號:2007AA02Z125）

541004 廣西，桂林醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室（黃大林，戴支凱）；復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)與微生物工程系（王鑫，李彬彬，鐘江）

△通訊作者 E-mail:jzhong@fudan.edu.cn

（2010-09-08收稿 2010-11-29修回）

（本文編輯 魏杰）