天然產(chǎn)物中二氫槲皮素分離純化及發(fā)展趨勢

徐紅艷包怡紅

（1.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133400）

天然產(chǎn)物中二氫槲皮素分離純化及發(fā)展趨勢

徐紅艷1，2包怡紅1

（1.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133400）

二氫槲皮素屬黃酮醇類化合物，因具有廣泛的生物功能和多種用途，從天然產(chǎn)物中獲取二氫槲皮素的研究日益受到人們的關注。文章對其分離純化方法進行介紹，主要有有機溶劑萃取法、沉淀分離法、微波輔助提取法、超聲－微波交替法、結(jié)晶與重結(jié)晶法、色譜法等等。通過各種方法的比較，分析概括各種方法的優(yōu)缺點，并對今后研究方法的應用方向進行展望。

二氫槲皮素；分離純化；發(fā)展趨勢

二氫槲皮素（dihydroquercetin）又名紫杉葉素、黃杉素、花旗松素（分子結(jié)構(gòu)式見圖1），為無色針狀結(jié)晶，易溶于乙醇、乙酸、沸水，稍溶于冷水，幾乎不溶于苯，屬二氫黃酮醇類化合物，是P族維生素，是一種應用廣泛的生物活性物質(zhì)和有效的抗氧化劑［1－2］，具有清除自由基、抗菌、抗病毒、抗癌、抗腫瘤、保護細胞內(nèi)酶等作用。有試驗［3］證明，二氫槲皮素能顯著減輕大鼠心肌缺血再灌注導致的心肌損傷并縮小心肌梗死面積，保護心功能；增加機體內(nèi)源性清除氧自由基的能力，抑制心肌缺血再灌注中活性氧自由基產(chǎn)生及其產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化反應。

圖1 二氫槲皮素的分子結(jié)構(gòu)式Figure 1 Molecular structural formula of dihydroquercetin

在食品業(yè)，二氫槲皮素可作為食品生物活性添加劑，加入到植物油、動物脂肪、干奶粉以及含脂肪的糖果、點心食品中以延長食品的有效期，添加到酒類中可使酒的性能得到改善。在制藥業(yè)，可利用二氫槲皮素保持血管壁良好柔韌性，提高紅細胞活性，抑制血小板之間的粘連等功能生產(chǎn)用于治療缺血性心臟病、保肝護肝、抗氧化、抗腫瘤和抗炎等藥物。在農(nóng)業(yè)，可用二氫槲皮素為主要原料生產(chǎn)植物生長調(diào)節(jié)劑，以增加植物的產(chǎn)量，提高抗病能力。在工業(yè)，二氫槲皮素還可作為火箭原料的抗震劑和穩(wěn)定劑，發(fā)電機油、工業(yè)油和碳氫化合物原料的穩(wěn)定劑以及顏料和油漆的抗氧化劑等等。由于二氫槲皮素的多種生物功能和廣泛的應用前景，從天然產(chǎn)物中分離純化二氫槲皮素的研究日益受到學者的重視。

二氫槲皮素的分離純化是指在天然產(chǎn)物中獲取二氫槲皮素的過程，這一過程主要是二氫槲皮素與其他非黃酮類化合物的分離以及黃酮類化合物之間的單體分離。一般包括提取、分離、純化、純度鑒定以及在天然產(chǎn)物中的含量測定。目前，天然二氫槲皮素主要是從落葉松中分離純化［4－7］所得，也有從刺玫薔薇莖中分離純化所得的報道［8－9］。所采用的分離純化方法主要有有機溶劑萃取法、沉淀分離法、微波輔助提取法、超聲－微波交替法、結(jié)晶與重結(jié)晶法、硅膠色譜法、凝膠色譜法、聚酰胺色譜法、高速逆流色譜法、高效液相色譜法等。

1 二氫槲皮素的初步分離純化方法

1.1 有機溶劑萃取法

有機溶劑萃取法是利用混合物中各組分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達到分離目的的方法。影響分離效果的主要因素包括：萃取劑、被萃取的物質(zhì)在萃取劑與原樣品溶液兩相之間的平衡關系、在萃取過程中兩相之間的接觸情況。在被萃取物質(zhì)一定的條件下，主要決定于萃取劑的選擇和萃取次數(shù)［10］。有機溶劑萃取法是天然有機化合物分離中常用的分離方法。目前，用于提取分離二氫槲皮素的有機溶劑主要是乙酸乙酯。王萍等［8－9］對刺玫薔薇莖的浸提液真空抽濾，加HCl或H2SO4水解，用乙酸乙脂萃取，再減壓濃縮，離心，分離得到二氫槲皮素粗品。

1.2 沉淀分離法

沉淀分離法是指在樣品溶液中加入某些溶劑或沉淀劑，通過化學反應或改變?nèi)芤旱膒H值、溫度等，使分離物質(zhì)以固相物質(zhì)形式沉淀析出的一種方法［10］。能否將物質(zhì)從溶液中析出，需要選擇適當?shù)某恋韯┖统恋項l件。而對于一些活性物質(zhì)的沉淀分離，必須考慮沉淀方法對目標成分的活性及化學結(jié)構(gòu)是否破壞，對于食品和醫(yī)藥中的目標成分的沉淀分離，還必須考慮殘留物對人體的危害。金建忠等［4－5］在落葉松粗提液中加入沉淀劑A并用飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到6，然后離心分離，沉淀用1mol/L HCl溶液轉(zhuǎn)溶，再經(jīng)乙酸乙酯萃取，結(jié)晶得二氫槲皮素。

1.3 微波輔助提取法

微波輔助提取法是采用微波和傳統(tǒng)的溶劑萃取法相結(jié)合從各種物質(zhì)中提取化學成分的一種新的萃取方法。微波萃取是利用微波照射物質(zhì)，高頻電磁波穿透萃取媒質(zhì)，使物料細胞內(nèi)的溫度突然升高，連續(xù)的高溫使內(nèi)部壓力超過細胞空間膨脹的壓力，導致細胞破裂，較短時間內(nèi)萃取出目標物質(zhì)的方法。它根據(jù)被照射物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同，對吸收微波能力的差異進行選擇性加熱，因此具有選擇性高、溶劑消耗少、有效成分提取率高、時間短等特點［11］，現(xiàn)已應用到天然產(chǎn)物有效成分的提取分離中，是一種全新的“綠色”萃取技術［12］。韓俊鳳等［7］采用微波輔助提取法，將落葉松碎屑浸潤后先進行微波處理，然后在水浴條件下加熱攪拌，過濾，減壓濃縮濾液。再向浸提液中加入聚酰胺，攪拌過濾，濾渣用乙酸乙酯重復洗滌，收集濾液，減壓蒸餾至干，最后獲得淡黃色粉末，即二氫槲皮素粗品。楊磊等［13］對超聲提取法、微波提取法和加熱提取法進行比較，分別采用250W超聲40min，700W 微波20min和攪拌下加熱（80℃回流）240min的方法從落葉松木粉中提取二氫槲皮素，結(jié)果表明在3種方法中，微波提取法提取得率最高，可達0.116%，回流提取法的累積得率可達微波提取法的95.9%，而超聲提取法的累積得率僅達到微波提取法累積得率的55.2%。

1.4 超聲－微波交替法

超聲－微波交替法就是利用超聲波法和微波法的交替作用，從各種物質(zhì)中提取目標成分的一種方法。馬春慧等［14］采用超聲－微波交替法從落葉松中提取二氫槲皮素，得率可達0.12%，明顯優(yōu)于單獨超聲提取得率的0.034%和單獨微波提取得率的0.074%，并通過掃描電子顯微鏡觀察超聲－微波交替法抽提效果最明顯。

2 二氫槲皮素的高度分離純化方法

2.1 結(jié)晶與重結(jié)晶

結(jié)晶是指物質(zhì)從不是結(jié)晶狀處理到結(jié)晶狀；重結(jié)晶是指從比較不純的結(jié)晶用結(jié)晶方法精制到較純的結(jié)晶，常用于天然有機化合物的提純和精制。用結(jié)晶和重結(jié)晶法分離純化有機化合物是利用要提純分離的化合物與其他化合物在有機溶劑中的溶解度差異及其與溫度的依賴關系不同，使要提純分離的化合物從其粗提混合物中分離出來。結(jié)晶法分離精制的關鍵是正確選擇溶劑和結(jié)晶的條件。席丹瑩等［15］將二氫槲皮素粗品用水重結(jié)晶5次以上，得到純度為95%的二氫槲皮素。金建忠等［4－5］對二氫槲皮素初步分離液采用減壓濃縮至干，用熱水溶解殘渣，冰箱冷凍（5℃）結(jié)晶，后快速離心，分離得到二氫槲皮素。

2.2 硅膠色譜

硅膠色譜是用硅膠作為固定相的液－固色譜分離法，能用于非極性化合物和用于極性化合物的分離，適用范圍廣，由于其價格低廉，可選擇的溶劑種類多，樣品損耗少，分離后溶劑易于除去，并且分離速度快，因此是常用的天然產(chǎn)物分離手段。謝周濤等［16］采用硅膠色譜分離和光譜分析研究水紅花子的化學成分，最后分離出7種化合物，其中一種是二氫槲皮素。王巖等［17］采用色譜和光譜分析法對顯齒蛇葡萄的化學成分進行了研究，經(jīng)分離和鑒定，得到二氫槲皮素等7種化合物，并且二氫槲皮素是首次從蛇葡萄屬植物中分得。鄭國華等［18］用色譜和光譜分析法在霉茶中提取分離出二氫槲皮素等7種化合物。

2.3 聚酰胺色譜

聚酰胺色譜法是通過酰胺基聚合而成的一類高分子化合物，分子中含有豐富的酰胺基，可與酚類、酸類、醌類、硝基化合物等形成氫鍵結(jié)合而被吸附，與不能形成氫鍵的化合物分離。由于二氫槲皮素中含有較多的酚羥基，所以聚酰胺色譜對其具有強吸附力。甘春麗等［19］采用聚酰胺柱色譜法，乙醇－水梯度洗脫，成功將槲皮素和二氫槲皮素的混合物進行了分離。王巖等［17］采用聚酰胺色譜法分離顯齒蛇葡萄的化學成分。對顯齒蛇葡萄粗提浸膏干法上樣，反復進行100～200目聚酰胺柱層析，以乙醇－水溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，得二氫槲皮素。

2.4 凝膠色譜

凝膠色譜是20世紀60年代發(fā)展起來的一種分離技術，使用的固定相是凝膠，凝膠是具有許多孔隙的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固體，有分子篩的性質(zhì)。凝膠可根據(jù)混合物中各組分相對分子質(zhì)量大小的不同對其進行分離，因此非常適合用于從樣品中除去高相對分子質(zhì)量成分及聚合物。當混合物通過凝膠相時，大分子不被遲滯而隨溶液走在前面，小分子則由于向孔隙內(nèi)擴散或移動得到滯留，所以落后于大分子而得到分離［20］。凝膠色譜不僅可作為一種有效的初步分離手段，還可被用于最后的分離，以除去最后微量的雜質(zhì)。王巖等［17］在分離顯齒蛇葡萄的化學成分研究中，洗脫液最后經(jīng)SephadexLH－20柱層析純化，分離得到二氫槲皮素。

2.5 高效液相色譜

高效液相色譜（HPLC）是在液相色譜中采用顆粒十分細的高效固定相，并采用高硅泵輸送流動相，全部工作通過儀器完成而實現(xiàn)對物質(zhì)進行分離分析的方法。高效液相色譜法具有分離效率高、產(chǎn)品純度高、操作方便等優(yōu)點［21］。即可用于定性分析，也可用于定量分析。對天然產(chǎn)物中二氫槲皮素的含量，常用高效液相色譜進行測定。王宇等［22］采用RPHPLC法測定落葉松中二氫槲皮素的含量，采用色譜柱HypersilODS－C18，流動相為甲醇－水－冰醋酸（40∶59∶1），柱溫28℃。結(jié)果顯示，在此條件下二氫槲皮素與其他組分得到良好的分離，線性范圍0.02～0.2μg/μL，（r＝0.999 8），精密度RSD為0.96%（n＝5），平均回收率為100.4%。樊鐵波等［23－25］采用HPLC法測松針中二氫槲皮素的含量、不同地區(qū)水紅花子中花旗松素含量和紅蓼不同提取部位花旗松素的含量，表明HPLC法可用于分離測定天然產(chǎn)物中二氫槲皮素的含量。

2.6 高速逆流色譜

高速逆流色譜（HSCCC）是一種不用固態(tài)支撐體的液－液分配色譜，分離原理是基于某一樣品在兩個互不混溶的溶劑之間的分配作用，溶質(zhì)中的各個組分在通過兩溶劑的過程中按不同的分配系數(shù)得以分離［20］。與液－固色譜法相比，可避免樣品的不可逆吸附現(xiàn)象，并可避免樣品因與某些固體固定相相互作用發(fā)生的破壞，對樣品的預處理要求也比較低，具有快速、高效的優(yōu)點［26］；與高效液相色譜相比具有上樣量更多的優(yōu)勢［27］。高速逆流色譜分離時，溶劑系統(tǒng)是最重要的因素。另外，主機轉(zhuǎn)速、流動相流速和樣品濃度等也是具有一定影響的因素［28］。Yun Wei等［29］采用溶劑系統(tǒng)為乙酸乙酯－甲醇－水 （25∶1∶25，V/V），從400mg中草藥仙鶴草粗提物中分離出11mg花旗松素－3－糖苷和槲皮素－3－半乳糖苷，分離純度達到96%，最后采用質(zhì)譜、核磁共振氫譜和13C－NMR譜進行了結(jié)構(gòu)鑒定。

3 各種分離純化方法的比較

將二氫槲皮素的分離純化方法進行綜合比較，見表1。由表1可見，色譜技術由于分離速度快，分離純度高等優(yōu)點，特別是高速逆流色譜，是今后分離純化二氫槲皮素優(yōu)選的方法。

表1 分離純化二氫槲皮素的方法比較Table 1 Comparison of methods of isolation and purification on dihydroquercetin

4 展望

在從天然產(chǎn)物中分離純化二氫槲皮素過程中，往往需要采用幾種不同的分離純化方法，進行多次有針對性的分離純化，從而實現(xiàn)從粗提到分離純化及純度鑒定的目的。隨著二氫槲皮素分離純化技術的發(fā)展，大大加快了從天然產(chǎn)物中獲取二氫槲皮素的發(fā)展進程，必將不斷提高其得率和分離純度，以滿足二氫槲皮素在食品和醫(yī)藥等領域的需求。

1 Shatalin V，Shmarev A N.Peroxidation of lecithin in the pres－ence of dihydroquercetin and its complex with ferrous iron ions［J］.Biofizika，2010，55（1）：75～82.

2 Chernyak Y I，Shchukina O G.Peroxidation processes in rats during the delayed period after chronic administration of dihydroquercetin［J］.Bull Exp.Biol.Med.，2009，147（5）：603～605.

3 師智勇，孫宗全，王國化.花旗松素對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用［J］.化中醫(yī)學雜志，2008，32（4）：287～289.

4 金建忠，申屠超，許惠英，等.落葉松中二氫槲皮素的提取及鑒定［J］.浙江林業(yè)科技，2004，24（5）：15～17.

5 金建忠.落葉松中二氫槲皮素的提取工藝研究［J］.林產(chǎn)化工通訊，2005，39（4）：12～15.

6 王宇，王遂.落葉松中二氫槲皮素提取工藝研究［J］.食品科學，2009（24）：141～143.

7 韓俊鳳，賈林艷.落葉松中二氫槲皮素的提取新工藝研究［J］.安微農(nóng)業(yè)科學，2009，37（24）：11 385～11 387.

8 王萍，梁坤.刺玫薔薇莖中二氫槲皮素的提取工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2008（3）：196～198.

9 王萍，賈斌，宋林平.刺玫薔薇莖中二氫槲皮素的提?。跩］.特產(chǎn)研究，2006（2）：53～55.

10 汪茂田，謝培山，王忠東，等.天然有機化合物提取分離與結(jié)構(gòu)鑒定［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2004：54～187.

11 朱曉薇，郭俊華，陳志娟，等.中藥微波提取的初步研究及微波提取特點分析［J］.天津中醫(yī)藥，2003，20（4）：65～66.

12 Wang X，Ding L，Zhang H，et al.Development of an analytical method for organotin compounds in fortified flour samples using microwave－assisted extraction and normal－phase HPLC with UV detection［J］.Jchromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.，2006，843（2）：268～274.

13 楊磊，馬春慧，黃金明，等.興安落葉松中二氫槲皮素提取方法的比較［J］.森林工程，2009，25（5）：6～11.

14 馬春慧，孫震，黃金明，等.超聲－微波交替法提取落葉松二氫槲皮素［J］.化工進展，2010（1）：134～139，145.

15 席丹瑩，王正平，寧正祥.二氫槲皮素衍生物的制備及其抗氧化性能研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2007，23（10）：29～31.

16 謝周濤，胡進.水紅花子乙酸乙酯部位化學成分研究［J］.中藥材，2009，32（9）：1 397～1 399.

17 王巖，周莉玲，李銳，等.顯齒蛇葡萄化學成分的研究［J］.中藥材，2002，25（4）：254～256.

18 鄭國華，楊娟，馮其麟.霉茶化學成分研究（II）［J］.中藥材，2009，32（3）：370～372.

19 甘春麗，王晶，楊異卉，等.聚酰胺柱色譜法分離黃酮醇與二氫黃酮醇類化合物［J］.哈爾濱醫(yī)科大學學報，2007，41（6）：552～554.

20 徐任生.天然產(chǎn)物化學［M］.第二版.北京：科學出版社，2004：4～20.

21 黃阿要，董瑞建.功能性成分提取與分離純化方法研究進展［J］.揚州大學烹飪學報，2006（1）：59～62.

22 王宇，王遂.RP－HPLC法測定落葉松中二氫槲皮素的含量［J］.化學工程師，2009（2）：22～24.

23 樊鐵波，劉紅煜，湯青，等.HPLC法測定松中二氫槲皮素含量［J］.中國藥師，2009（8）：1 046～1 048.

24 張元桐，翟延君，康廷國，等.HPLC法測定不同地區(qū)水紅花子中花旗松素含量［J］.中國中藥雜志，2007，32（20）：2 190～2 191.

25 魏艷，陳曉青，馬志祥，等.紅蓼不同提限部位花旗松素和總黃酮含量的測定［J］.中成藥，2008，30（12）：1 853～1 855.

26 彭愛一，曲學偉，李慧，等.高速逆流色譜分離純化九里香中的黃酮類化合物［J］.色譜，2010，28（4）：383～387.

27 Yao S，Luo J，Huang X，et al.Application of preparative highspeed counter chromatography/prepatative high－performance liquid chromatography mode in rapid separation of saponins［J］.Jourmal of Chromatography B，2008（864）：69～77.

28 陶鋒，李向榮，占潔.黃酮醇類化合物提取分離方法的研究進展［J］.中藥材，2008，31（10）：1 586～1 589.

29 Yun Wei，Qianqian Xie，Yoichiro Ito.Preparative separation of axifolin－3－glucoside，hyperoside and amygdalin from plant extracts by high－speed countercurrent chromatography［J］.J.Liq.Chromatogr Relat Technol.，2009，32（7）：1 010～1 022.

Present status and developing trend of isolation and purification on dihydroquercetin from natural products

XU Hong－yan1，2BAO Yi－h(huán)ong1

（1.Forestry College of Northeast Forestry University，Haerbin，Heilongjiang150040，China；2.Agricultural College of Yanbian University，yanji，Jilin133000，China）

Dihydroquercetin is a flavonol，it has a lot of biological function and use，so studies on dihydroquercetin from natural products have been followed with interest.This paper introduced the methods of isolation and purification on dihydroquercetin from natural products.There are organic solvent extraction，doposit isolation，microwave－assisted extraction，ultrasonic wave by turn microwave extraction，crystallization and repeating crystallization，chromatography etc.Through contrasting these methods，analyzed and summarized advantages and disadvantages of every method，and looked forward applicative direction of research methods in the future.

dihydroquercetin；isolation and purification；developing trend

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.049

徐紅艷（1975－），女，延邊大學講師，東北林業(yè)大學在讀博士。E－mail：xuhongyan0291＠hotmail.com

包怡紅

2010－06－11