酶法制備瓜爾膠半乳甘露低聚糖的研究

傅 亮何紫姣李存芝陳 勇孫穎鶯

（1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2.佛山市廣糧飲料食品有限公司，廣東 佛山 528137）

酶法制備瓜爾膠半乳甘露低聚糖的研究

傅 亮1何紫姣1李存芝1陳 勇2孫穎鶯2

（1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2.佛山市廣糧飲料食品有限公司，廣東 佛山 528137）

以瓜爾膠為原料，采用β－甘露聚糖酶酶法制備半乳甘露低聚糖。通過單因素試驗(yàn)及L9（34）正交試驗(yàn)對酶解反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證。結(jié)果表明，其最佳反應(yīng)條件為：瓜爾膠濃度0.5%，加酶量20IU/g，pH 6.0，50℃，反應(yīng)時間8h。在此條件下，酶解率為24.2%，平均聚合度為4.13。采用高效液相色譜定性分析發(fā)現(xiàn)，酶解產(chǎn)物是以二糖為主要成分的半乳甘露低聚糖。

瓜爾膠；β－甘露聚糖酶；半乳甘露低聚糖

瓜爾膠（guar gum）又名瓜膠、瓜爾豆膠，是一種天然半乳甘露聚糖膠。其主鍵為（1－4）－β－D－甘露糖單位，側(cè)鍵則由單個的α－D－半乳糖以（1－6）鍵與主鏈相連接，在主鍵上平均每兩個甘露糖單位中有一個半乳糖單位在C－6位與之相連，甘露糖對半乳糖之比為1.8∶1（約為2∶1）［1］。β－1，4－D－甘露聚糖水解酶是一類從甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的主鏈內(nèi)部隨機(jī)切割β－1，4－D－甘露糖苷鍵的水解酶，簡稱β－甘露聚糖酶（β－mannanase）［2］，廣泛存在于動植物和微生物中。據(jù)文獻(xiàn)［3］報道，某些植物膠（如魔芋膠、角豆膠、瓜爾豆膠、田菁膠等）經(jīng)β－甘露聚糖酶水解后的產(chǎn)物含有不同單糖分子組成的低聚糖。

半乳甘露低聚糖（galacto－mannan－oligosaccharides，簡稱GMOS）是低聚糖家族的新成員，是半乳甘露聚糖的不完全降解產(chǎn)物，它能顯著增進(jìn)人體腸道內(nèi)以雙歧桿菌為代表的有益菌的增殖，且具有減少動物腸道病原菌、增強(qiáng)免疫、提高腸黏膜功能等多種特性［4－7］。目前，在日本已有以瓜兒膠為原料制備的甘露低聚糖功能食品，但中國多是用魔芋膠制取葡甘露低聚糖［8－10］，而且對由瓜爾膠制備半乳甘露低聚糖的研究較少。隨著瓜爾豆在中國的推廣種植［11］，用瓜爾膠為原料制備半乳甘露低聚糖將會具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本試驗(yàn)采用β－甘露聚糖酶對瓜兒膠進(jìn)行酶解，優(yōu)化酶法制備半乳甘露低聚糖的工藝條件，并對酶解產(chǎn)物進(jìn)行定性檢測，旨在為產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓜爾膠：廣東大地食用化工有限公司；

β－甘露聚糖酶：昆明愛科特生物科技有限公司；

甘露糖、甘露二糖：廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

定時恒溫磁力攪拌器：90－2型，上海滬西分析儀器有限公司；

數(shù)字旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)：SNB－1型，上海恒平科學(xué)儀器有限公司；

可見光分光光度計(jì)：JH 722S型，上海菁華科技儀器有限公司；

高效液相色譜分析儀：Shimadzu LC－20AT型，日本島津公司；

示差折光檢測器：RID－10A型，日本島津公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 β－甘露聚糖酶活力的測定 參照文獻(xiàn)［12］。取0.5%的瓜爾膠溶液（pH 5.0的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液配置）20mL，加入0.1mL用pH 5.0緩沖液配置的粗酶液，于50℃反應(yīng)30min，用DNS法測還原糖量。在上述試驗(yàn)條件下，以每分鐘水解底物產(chǎn)生1μmol還原糖（以甘露糖計(jì)）所需的酶量定義為一個β－甘露聚糖酶酶活單位（IU/g）。

1.3.2 黏度測定 采用SNB－1數(shù)字旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)。

1.3.3 瓜爾膠總糖測定 準(zhǔn)確稱取0.05g瓜爾膠置于20mL具塞試管內(nèi)，依次加入10mL水和0.4mL濃硫酸，于100℃水解2h，冷卻后用NaOH中和，然后定容100mL。取1.0mL用DNS法測定還原糖（以甘露糖計(jì)）量，計(jì)算總糖量?？偺呛堪垂剑?）計(jì)算：

1.3.4 瓜爾膠酶解率 不同濃度的瓜爾膠溶液中加入一定活力單位的β－甘露聚糖酶（加酶量以IU/g瓜爾膠計(jì)），于不同溫度下反應(yīng)一定時間，取樣適當(dāng)稀釋后用DNS法測定酶解液中的還原糖（以甘露糖計(jì)）量。酶解率按公式（2）計(jì)算：

1.3.5 平均聚合度（DP） 聚合度為寡糖中組成寡糖的單糖單位的個數(shù)［13］。半乳甘露低聚糖的DP按公式（3）計(jì)算：

1.3.6 酶解產(chǎn)物高效液相色譜定性檢測 酶解液加入2倍體積的無水乙醇，靜置后離心，取上清液，濃縮，采用高效液相色譜儀定性分析。色譜條件：色譜柱Kromasil 100－5NH2（150×4.6mm），柱溫40℃，流速1mL/min，進(jìn)樣量20μL，流動相為乙腈∶水＝70∶30，示差折光檢測器分析。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 單因素試驗(yàn) 以酶解率和DP為指標(biāo)，依次分別對加酶量、底物濃度、酶解溫度、pH值和反應(yīng)時間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在0.5%的瓜爾膠溶液中分別加入10，15，20，25，30，40IU/g的β－甘露聚糖酶，于pH 5.0，50℃反應(yīng)30min，以確定最佳加酶量；分別配置濃度為0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0% 的瓜爾膠溶液，各加入β－甘露聚糖酶20IU/g，于pH 5.0，50℃反應(yīng)30min，以選擇合適的底物濃度；在0.5%的瓜爾膠溶液中加入20IU/gβ－甘露聚糖酶，分別在pH 5.0，溫度分別為30，40，45，50，55，60，70，80℃的條件下反應(yīng)30min，以確定合適的反應(yīng)溫度；分別用pH 4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的緩沖液配置0.5%的瓜爾膠溶液，各加入20IU/gβ－甘露聚糖酶，于50℃反應(yīng)30min，以選擇最佳pH；0.5% 的 瓜 爾 膠 溶 液 加 入 20IU/gβ－甘 露 聚 糖 酶，pH 5.0，50℃進(jìn)行反應(yīng)，在1～10h內(nèi)，每間隔1h取樣測定酶解率，以確定合適的酶解反應(yīng)時間。每個水平重復(fù)3次，測定結(jié)果并取平均值。

1.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 由于瓜爾膠酶解過程不僅受加酶量、底物濃度、溫度、時間、pH等因素影響，而且這些因素還存在復(fù)雜的交互作用，故而設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，以確定酶解瓜爾膠制備半乳甘露低聚糖的最佳條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以甘露糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），得出回歸方程為：y＝0.012 4x－0.016，線性相關(guān)系數(shù)R2＝0.998 6。

圖1 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of mannose

2.2 黏度測定

瓜爾膠酶解前后的黏度變化測定結(jié)果見表1。1%的瓜爾膠黏度為4 294MPa·s，加入一定量β－甘露聚糖酶后，在5min后，黏度迅速下降，說明β－甘露聚糖酶能很好的降解瓜爾膠?？衫眠@種特性，通過補(bǔ)充底物的方式獲得高濃度的水解液。

表1 酶解過程中瓜爾膠溶液的黏度變化Table 1 The change of guar gum’s viscosity during hydrolysis

2.3 瓜爾膠總糖測定

0.05 g瓜爾膠被濃硫酸水解后中和定容至100mL，取1mL測定還原糖量。通過計(jì)算測得瓜爾膠總糖含量為77.1%。

2.4 酶解試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過單因素試驗(yàn)，分別獲得各因素的最佳試驗(yàn)結(jié)果，即加酶量20IU/g、瓜爾膠濃度0.5%、酶解溫度45℃、pH 6、時間8h?？紤]到高濃度的瓜爾膠因?yàn)轲ざ冗^大而不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，故在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定瓜爾膠溶液濃度為0.5%，選擇加酶量、酶解溫度、酶解pH和時間4因素設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，以確定酶解瓜爾膠制備半乳甘露低聚糖的最佳條件。正交試驗(yàn)因素及水平見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。根據(jù)正交結(jié)果分析，pH對酶解率的影響最大，其次是加酶量，反應(yīng)時間和溫度對酶解率率的影響相對較小。酶解的最佳條件為A2B3C2D2，即瓜爾膠濃度0.5%，加酶量20IU/g，pH 6.0，50℃，反應(yīng)時間8h。由于此條件在正交表中并未列入，故按此條件進(jìn)行驗(yàn)證［14］，測得其酶解率為24.2%，平均聚合度為4.13，優(yōu)于正交表中的試驗(yàn)值。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Factor and level of orthogonal test（n＝3）

表3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment（n＝3）

2.5 酶解產(chǎn)物高效液相色譜定性分析

分別取甘露糖和甘露二糖標(biāo)準(zhǔn)溶液以及酶解液進(jìn)行高效液相色譜檢測，結(jié)果見圖2。

圖2 瓜爾膠酶解液高效液相色譜圖Figure 2 HPLC of guar gum hydrolysate

根據(jù)甘露糖和甘露二糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時間（分別是3.667和4.234）分析，酶解產(chǎn)物中主要以二糖為主。

3 結(jié)論

由于酶解反應(yīng)可以在短時間內(nèi)降低瓜爾膠的黏度，因此在工業(yè)生產(chǎn)上，可以采用批量添加瓜爾膠的方式，從而獲得高濃度的水解液。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)確定酶解制備半乳甘露低聚糖的最佳反應(yīng)條件為瓜爾膠濃度0.5%，加酶量20IU/g，pH 6.0，50℃，反應(yīng)時間8h。在此條件下，酶解率為24.2%，平均聚合度為4.13。經(jīng)HPLC定性檢測，瓜爾膠酶法制備的半乳甘露低聚糖以二糖為主。

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Enzymatic preparation of galacto－mannan－oligosaccharides from guar gum

FU Liang1HE Zi－jiao1LI Cun－zhi1CHEN Yong2SUN Ying－ying2

（1.Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou，Guangdong，510632，China；2.Foshan Guangliang Drink and Food Inc.，F(xiàn)oshan，Guangdong528137，China）

Guar Gum was used as raw material to prepare Galacto－Mannan－Oligosaccharides（GMOS）byβ－Mannanase.The factors，including the guar gum concentration，pH value，temperature，enzyme amount and reaction time on the hydrolysis of guar gum were studied respectively.Based on the results，the orthogonal experiment was designed to obtain optimized conditions for GMOS.The result indicated that pH was the most critical factor on the rate of hydrolysis，and then the enzyme amount.Reaction time and temperature had relatively low effect on the rate of hydrolysis.The optimum enzymatic hydrolysis conditions were guar gum concentration 0.5%，enzyme amount 20IU/g，pH 6.0，50℃，8h.Under optimal conditions，the hydrolysis rate was 24.2%，and the polymerization in average degree was 4.13.The hydrolysate was detected by high performance liquid chromatography（HPLC）and the result showed that the main component of GMOS was disaccharide.

guar gum；β－mannanase；galacto－mannan－oligosaccharides

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.035

傅亮（1968－），男，暨南大學(xué)副教授，博士。E－mail：fuliang＠188.com

2010－05－01