竹紅菌素培養(yǎng)基的初步優(yōu)化

胡明明蔡宇杰廖祥儒胡 艷李枝鈴張大兵

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江蘇漢邦科技有限公司，江蘇 淮安 223001）

竹紅菌素培養(yǎng)基的初步優(yōu)化

胡明明1蔡宇杰1廖祥儒1胡 艷1李枝鈴2張大兵2

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江蘇漢邦科技有限公司，江蘇 淮安 223001）

利用竹黃菌株通過(guò)液態(tài)發(fā)酵的方法獲得活性成分竹紅菌素系列化合物。首先采用單因素的分析方法找到了竹黃菌比較合適的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨作為培養(yǎng)基氮源，葡萄糖作為培養(yǎng)基碳源。然后利用響應(yīng)面法分析探討蛋白胨和葡萄糖的最佳濃度。結(jié)果表明，蛋白胨最佳濃度為1.82g/L，葡萄糖的最佳濃度為2.42g/L。優(yōu)化后竹紅菌素產(chǎn)量為0.62g/L。

竹紅菌素；液態(tài)發(fā)酵；優(yōu)化培養(yǎng)基

竹黃（shiraia bambusicola），別名竹花、竹繭、竹赤團(tuán)子等，是一種傳統(tǒng)的名貴中藥。竹黃中的有效成分主要是竹紅菌素系列化合物。由于竹紅菌素具有良好的光敏特性，作為很有潛力的光敏劑受到廣泛關(guān)注和研究，它具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌抗腫瘤等作用［1－2］。同時(shí)作為新型的光活化農(nóng)藥和光電轉(zhuǎn)換材料，在國(guó)內(nèi)外得到了廣泛研究［3］。

直接從野外竹黃中提取竹紅菌素國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)［4－5］有過(guò)報(bào)道。但是野外竹黃資源有限。蔡宇杰等［6－7］通過(guò)固態(tài)發(fā)酵的方法來(lái)獲得竹紅菌素，但固態(tài)發(fā)酵周期長(zhǎng)，不易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。本試驗(yàn)對(duì)竹黃菌液態(tài)發(fā)酵法制備竹紅菌素的培養(yǎng)基進(jìn)行初步優(yōu)化，旨在為將來(lái)大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培養(yǎng)方法

Shiraia bambusicola：本實(shí)驗(yàn)室保藏，裝液量 50mL（250mL三角瓶），初始pH調(diào)到6.5，滅菌后接入2mL種子液，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)72h。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：葡萄糖2%，馬鈴薯20%，瓊脂2%，pH值自然，115℃滅菌30min。

（2）液體種子培養(yǎng)基：ZnSO4·7H2O 0.1g/L，KCl 0.1g/L，葡萄糖 1.5g/L，牛肉膏 1.5g/L，pH 值自然，115℃ 滅菌30min。

（3）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：同1.1.2（2）。

1.1.3 主要儀器

生化培養(yǎng)箱：LRH－250A，廣東省醫(yī)療器械廠；

全溫度搖床柜：HYG－B，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；

循環(huán)水多用真空泵：SHZ－3，上海滬西分析儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：YXQ－LS－50SII，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

單人單面凈化工作臺(tái)：SW－CJ－1FD，蘇州凈化有限公司；

分光光度計(jì)：UV－1600PC，上海美譜達(dá)有限公司。

1.2 分析方法

1.2.1 竹紅菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 用紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)在465nm處測(cè)定一系列竹紅菌素純品（本實(shí)驗(yàn)室自制，純度＞99%）無(wú)水乙醇溶液的吸光度，對(duì)竹紅菌素溶液濃度y（mg/L）和相應(yīng)的吸光值x進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到線(xiàn)性回歸方程y＝0.126x＋0.001（R2＝0.999）。

1.2.2 竹紅菌素含量測(cè)定 將一定量的菌絲與一定比例的無(wú)水乙醇混合，浸提24h，過(guò)濾后得到澄清提取液，用無(wú)水乙醇適當(dāng)稀釋定容后，采用分光光度法在465nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值［8］，根據(jù)回歸方程計(jì)算竹紅菌素的含量 （以下發(fā)酵液中竹紅菌素含量均為浸提1次的數(shù)據(jù)）。

1.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化方法

1.3.1 氮源篩選試驗(yàn) 以0.012mol/L的含氮量為標(biāo)準(zhǔn)，向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入的酵母膏、蛋白胨、酒石酸銨、氯化銨、硝酸銨代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的牛肉膏。

1.3.2 碳源篩選試驗(yàn) 以0.05mol/L的含碳量為標(biāo)準(zhǔn)，向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入蔗糖、果糖、可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖。

1.3.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及模型的建立均采用MATLAB軟件進(jìn)行，響應(yīng)值為色素的產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源對(duì)竹黃菌發(fā)酵產(chǎn)色素的影響

由圖1可知，有機(jī)氮源對(duì)竹黃菌發(fā)酵產(chǎn)色素更為有利，無(wú)機(jī)氮源對(duì)色素的合成有明顯的抑制作用。有機(jī)氮源中蛋白胨對(duì)色素合成最為有利，所以選擇蛋白胨作為竹黃菌發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

圖1 氮源對(duì)竹黃菌液態(tài)發(fā)酵的影響Figure 1 Effect of nitrogen sources on liquid fermentation of Shiraia bambusicola

2.2 碳源對(duì)竹黃菌發(fā)酵產(chǎn)色素的影響

由圖2可知，碳源的種類(lèi)對(duì)色素的合成有較大的影響，小分子的糖類(lèi)比大分子糖類(lèi)更有利于色素的合成，小分子糖類(lèi)中以葡萄糖的效果最好，所以選擇葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

圖2 碳源對(duì)竹黃菌液態(tài)發(fā)酵的影響Figure 2 Effect of carbon sources on liquid fermentation of Shiraia bambusicola

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的分析

以葡萄糖、蛋白胨為自變量，通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定自變量的水平取值（見(jiàn)表1）。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factor and level of response sueface

響應(yīng)面分析及結(jié)果見(jiàn)表2，響應(yīng)面回歸分析見(jiàn)表3，響應(yīng)面影響因素方差分析見(jiàn)表4，響應(yīng)面設(shè)計(jì)方差分析見(jiàn)表5。

表2 響應(yīng)面分析方案和試驗(yàn)結(jié)果?Table 2 Result and design of response surface analysis

表3 響應(yīng)面回歸分析結(jié)果Table 3 Result of response surface analysis

表4 響應(yīng)面影響因素方差分析Table 4 Result of response surface factor ANOVA analysis

運(yùn)用MATLAB軟件對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到二次多項(xiàng)式的回歸方程：

經(jīng)F檢驗(yàn)，F(xiàn)（X1）＝27.47＞F0.01（3，7）＝5.89，F(xiàn)（X2）＝41.75＞F0.01（3，7）＝5.89，說(shuō)明響應(yīng)面分析的組成因素影響在α＝0.01是顯著的，亦即試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值y具有顯著的影響。

表5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方差分析Table 5 Result of response surface ANVOA analysis

經(jīng)F檢驗(yàn)，模型的F＝36.79＞F0.01（5，7）＝7.46，這表明了所得的擬合方程在α＝0.01的水平上是顯著的，即響應(yīng)值y與各試驗(yàn)因素之間存在顯著的線(xiàn)性關(guān)系。

進(jìn)一步對(duì)回歸方程的各項(xiàng)回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，方差分析的結(jié)果表明：各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值y的影響不是簡(jiǎn)單的一次線(xiàn)性關(guān)系，而是二次關(guān)系。交互項(xiàng)交互項(xiàng)F值較小說(shuō)明了試驗(yàn)因素的相互作用不明顯。失擬項(xiàng)F＝3.61＜F0.01（3，7）＝5.89，這說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著，該模型的決定系數(shù)R2＝0.963 3，表示方程能夠解釋96.33%的色素產(chǎn)量變化，綜上所述，該模型方程能夠代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。圖3繪制出了響應(yīng)面設(shè)計(jì)的三維圖。

方程（1）中X21和X22的系數(shù)均為負(fù)數(shù)，方程拋物線(xiàn)的開(kāi)口方向向下，所以方程存在最大值點(diǎn)。對(duì)方程（1）進(jìn)行求導(dǎo)，解得響應(yīng)值y取得最大時(shí)，葡萄糖的濃度為2.42g/L，蛋白胨的濃度為1.82g/L，此時(shí)模型的最大響應(yīng)值為0.55g/L。為了證實(shí)響應(yīng)面所得的預(yù)測(cè)結(jié)果，在上述所得兩因子點(diǎn)進(jìn)行了重復(fù)試驗(yàn)，得到的色素產(chǎn)量為（0.62±0.09）g/L，預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)所得的數(shù)值之間具有良好的擬合性。由此證實(shí)了該模型的有效性。

圖3 響應(yīng)面立體曲面圖Figure 3 3Dmap of response surface

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定培養(yǎng)基的最適氮源為蛋白胨，最適碳源為葡萄糖。蔡宇杰等［9］所做的固態(tài)發(fā)酵色素產(chǎn)量為40mg/L，陳佳佳等［10］從每升發(fā)酵液中獲得色價(jià)為52的色素8g，但其發(fā)酵周期為96h，比本試驗(yàn)的發(fā)酵周期長(zhǎng)。

1 王景祥.竹黃的研究概況［J］.中草藥，1999，30（6）：477～479.

2 Yu J S，Xiao Y Y，Sheng Q R，et al.Natural colourant from shiraia bambusicola：Stability and antimicrobial activity of hypocrellin extract［J］.International Journal of Food Science and Technology，2009（44）：2 531～2 537.

3 張儉，馬嵐.竹紅菌素研究的進(jìn)展［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，25（增刊）：184～188.

4 蘇宇杰，印小艷，蔡宇杰，等.竹黃中竹紅菌素的提取及穩(wěn)定性研究［J］.食品添加劑，2009，30（2）：261～264.

5 Xiao H L，Yu J C，Xiang G L，et al.Isolation and identification of a new hypocrellin－producing stain shiraia sp.Super－h(huán)168［J］.Microbiological Research，2009（164）：9～17.

6 Yu J C，Xiao H L，Xian G L，et al.High－yield hypocrellin a production in solid－state fermentation by shiraia sp super－h(huán)168［J］.Appl.Biochem.Biotechnol，2010（160）：2 275～2 286.

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8 劉為忠，李聰，陳遠(yuǎn)騰，等.苝醌類(lèi)化合物總量的測(cè)定［J］.云南化工，2000，27（2）：35～37.

9 蔡宇杰，張大兵，丁彥蕊，等.竹黃菌固態(tài)發(fā)酵竹紅菌素條件的研究［J］.生物技術(shù)，2004，14（4）：46～47.

10 陳佳佳，李兆蘭，焦慶才.竹黃無(wú)性株的液態(tài)發(fā)酵工藝研究［J］.中藥材，20005，28（12）：1 049～1 051.

Optimization on submerged fermentation media of hypocrellin

HU Ming－ming1CAI Yu－jie1LIAO Xiang－ru1HU Yan1LI Zhi－ling2ZHANG Da－bing2

（1.School of biotechnology，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu214122，China；2.Jiangsu Hanbang Science＆Technology Co.Ltd，Huai’an，Jiangsu223001，China）

Hypocrellin were obtained by the submerged fermentation of shiraia bambusicola.Firstly，the suitable nutritional conditions of submerged fermentation for Shiraia bambusicola were determined through single factor test.The optimum fermentation culture was composed of Peptone and glucose.Then their optimum concentration was studied through response surface：Peptone 1.82g/L and glucose 2.42g/L.The production of hypocrellin was 0.62g/L in optimizing conditions.

hypocrellin；submerged fermentation；optimum the fermentation media

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.041

國(guó)家應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)資金政策引導(dǎo)類(lèi)計(jì)劃（編號(hào)：2009GJC10038）

胡明明（1985－），男，江南大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：hmmhll＠163.com

蔡宇杰，廖祥儒

2010－06－01