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    響應(yīng)面法提取灰樹花多糖研究

    2010-12-28 06:58:38孫金旭朱會霞高小寬李書珍
    食品與機(jī)械 2010年5期
    關(guān)鍵詞:樹花響應(yīng)值發(fā)酵液

    孫金旭 朱會霞 高小寬 李書珍

    陳 堯 林高強(qiáng) 周成銘

    (衡水學(xué)院,河北 衡水 053000)

    響應(yīng)面法提取灰樹花多糖研究

    孫金旭 朱會霞 高小寬 李書珍

    陳 堯 林高強(qiáng) 周成銘

    (衡水學(xué)院,河北 衡水 053000)

    利用試驗設(shè)計軟件Design-Expert,通過二次回歸設(shè)計得到灰樹花多糖提取量與提取溫度、提取時間、乙醇濃度關(guān)系的回歸模型,該模型能夠較好地預(yù)測灰樹花多糖提取量。在對影響多糖提取量的關(guān)鍵因素及其相互作用進(jìn)行探討后,得到的優(yōu)化提取工藝參數(shù)為:提取溫度11℃、提取時間10.35h、乙醇濃度96%,此條件下,多糖的提取量為1.72g/L。

    灰樹花;響應(yīng)面;提??;多糖

    灰樹花多糖是灰樹花中的重要活性物質(zhì)之一。藥理研究[1]證明,灰樹花多糖有明顯的抗腫瘤、抗肝炎、降低血壓,免疫調(diào)節(jié)之功效。目前已經(jīng)開發(fā)了多種灰樹花多糖保健品[2]。采用生物技術(shù)方法利用液體發(fā)酵培養(yǎng)灰樹花真菌菌絲體,并利用發(fā)酵液提取灰樹花多糖是目前最經(jīng)濟(jì),最符合環(huán)保的方法[3]。但發(fā)酵培養(yǎng)后,由于發(fā)酵液成分復(fù)雜,灰樹花多糖的分離提取存在很大困難。目前,對灰樹花多糖的提取主要使用醇沉法,對醇沉條件的優(yōu)化僅限于使用正交法,而對灰樹花多糖醇沉法進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化的未見報道,正交法得到的工藝條件并非真實意義的最佳條件,只是理想條件,不能給出整個區(qū)域上的最優(yōu)值。響應(yīng)面分析法(RSM)是一種尋找多因素中最佳條件的統(tǒng)計方法,本試驗利用醇沉法對灰樹花發(fā)酵液中的灰樹花胞外多糖進(jìn)行分離提取,并對灰樹花多糖的醇提條件進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化研究,以期提高灰樹花多糖的提取量。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    灰樹花菌種:本實驗室保藏;

    離心機(jī):DT5-3B,北京時代北利離心機(jī)有限公司;

    發(fā)酵罐(7L):TY4246,上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 灰樹花多糖提取工藝

    灰樹花真菌7L發(fā)酵罐培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度28℃、轉(zhuǎn)速200r/min、通氣量100L/h、培養(yǎng)時間10d)→灰樹花發(fā)酵培養(yǎng)液→離心沉淀除菌體(3 000r/min)→灰樹花發(fā)酵液→醇沉→灰樹花粗多糖

    1.2.2 灰樹花多糖醇沉條件單因素試驗設(shè)計

    (1)醇沉溫度的影響:經(jīng)離心處理后的灰樹花菌體發(fā)酵上清液,在乙醇濃度95%,pH值7.0,時間8h的條件下,分別設(shè)定-4,4,10,20,30,40℃的醇沉溫度,進(jìn)行醇沉試驗,測定其多糖提取量。

    (2)醇沉?xí)r間的影響:經(jīng)離心處理后的灰樹花菌體發(fā)酵上清液,在乙醇濃度95%,醇沉溫度10℃,pH值7.0的條件下,分別設(shè)定2,4,6,8,10,12h的醇沉?xí)r間,進(jìn)行醇沉試驗,測定其多糖提取量。

    (3)乙醇濃度的影響:經(jīng)離心處理后的灰樹花菌體發(fā)酵上清液,在醇沉溫度10℃,醇沉?xí)r間10h,pH值7.0的條件下,分別 設(shè) 定 70%,75%,80%,85%,90%,95%,100% 的 乙醇濃度,進(jìn)行醇沉試驗,測定其多糖提取量。

    1.2.3 灰樹花多糖提取工藝的響應(yīng)面分析 采用Box-Behnken試驗設(shè)計方案[6],根據(jù)單因素試驗結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗,運(yùn)用SAS軟件的 RSREG (response surface regression)程序?qū)υ囼烖c(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行分析。

    1.2.4 灰樹花多糖的測定 通過發(fā)酵罐液體培養(yǎng)獲得灰樹花真菌發(fā)酵液,發(fā)酵液3 000r/m離心處理得到發(fā)酵上清液,將得到的發(fā)酵上清液用乙醇進(jìn)行醇沉,采用苯酚-硫酸法測定總糖及還原糖的含量。多糖含量按式(1)計算:

    2 結(jié)果與討論

    2.1 灰樹花真菌多糖提取單因素試驗

    2.1.1 醇沉溫度對灰樹花多糖提取量的影響 由圖1可知,隨著醇沉溫度的升高,灰樹花多糖提取量也逐漸上升。當(dāng)醇沉溫度達(dá)10℃時,多糖提取量達(dá)到最高(1.45g/L),醇沉溫度繼續(xù)升高時,多糖提取量反而有所減少。分析原因可能為低溫不利于灰樹花多糖的溶出,溫度過高,其他雜質(zhì)溶出過多,影響到灰樹花多糖溶出的緣故。故10℃為灰樹花多糖提取的最佳溫度。

    圖1 醇沉溫度對灰樹花真菌多糖提取量的影響Figure 1 The extracting temperature impact for Grifola frondosa polysaccharides extracting

    2.1.2 醇沉?xí)r間對灰樹花多糖提取量的影響 由圖2可知,隨著醇沉?xí)r間的延長,灰樹花真菌多糖提取量也依次增加,到10h時多糖提取量達(dá)到最高(1.50g/L),高于10h提取,多糖量下降。故10h醇沉?xí)r間為灰樹花多糖提取的最佳時間。

    2.1.3 乙醇濃度對灰樹花真菌多糖提取量的影響 由圖3可知,隨乙醇濃度的上升,灰樹花多糖的提取量也逐漸上升,當(dāng)乙醇濃度達(dá)到95%時,灰樹花多糖的提取量最高(1.64g/L),乙醇濃度繼續(xù)升高,多糖量有所下降,故95%的乙醇濃度為灰樹花多糖提取的最佳濃度。

    圖2 醇沉?xí)r間對灰樹花真菌多糖提取量的影響Figure 2 The extracting time impact for Grifola frondosa polysaccharides extracting

    圖3 乙醇濃度對灰樹花真菌多糖提取量的影響Figure 3 The ethanol volume percentage impact for Grifola frondosa camphorata polysaccharides extracting

    2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化灰樹花多糖提取條件

    根據(jù)單因素試驗結(jié)果,對提取溫度、提取時間、乙醇濃度3因素3水平共15個試驗點(diǎn)(3個中心點(diǎn))進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗,響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)計見表1。

    表1 響應(yīng)面法灰樹花真菌多糖提取因素水平Table 1 The factors and levels of response surface for Grifola frondosa

    運(yùn)用SAS軟件的RSREG程序?qū)?5個響應(yīng)值進(jìn)行分析。15個試驗點(diǎn)可分為兩類:一是析因點(diǎn),自變量取值構(gòu)成的三維頂點(diǎn),共有12個析因點(diǎn);二是零點(diǎn),區(qū)域的中心點(diǎn),零點(diǎn)試驗重復(fù)3次,用以估計試驗誤差,以多糖提取量(Y1)為響應(yīng)值,經(jīng)回歸擬合后,確定函數(shù)表達(dá)式。試驗結(jié)果見表2。

    2.3 模型的建立與顯著性檢驗

    用Design Expert軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,選擇對響應(yīng)值顯著的各項,可得提取溫度、提取時間、乙醇濃度與灰樹花多糖提取量之間的多項回歸方程,回歸方程為:

    回歸方程顯著性檢驗、方差分析及最佳點(diǎn)值分析,結(jié)果見表3。

    表2 響應(yīng)面數(shù)據(jù)方案及試驗結(jié)果Table 2 The data plan and result for response surface

    表3 三因素三水平中心組和參數(shù)估計Table 3 The parameter estimating and central division for three facters and levels

    對表3數(shù)據(jù)驚醒回歸分析,結(jié)果顯著,模型相關(guān)系數(shù)的平方即R2=99.32%,回歸方程擬合程度良好,失擬性較小,可用該方程代替真實試驗點(diǎn)進(jìn)行分析。由P值可知,方程的X1、X2、X3、X1X1、X2X2和X3X3對Y值影響極顯著,表明該方程并非簡單的線性關(guān)系,方程二次項對響應(yīng)值影響也很大,交互項影響不顯著,因此交互作用影響較小。失擬項p=0.381 8,無顯著性影響,表明數(shù)據(jù)沒有異常點(diǎn),不需要分析更高次數(shù)的項,模型適當(dāng)。

    通過軟件分析,當(dāng)灰樹花多糖產(chǎn)量最高時:X1=0.077 58;X2= 0.173 208;X3= 0.232 336,計算后最佳工藝為:提取溫度11℃、提取時間10.35h、乙醇濃度96%。此條件下,多糖理論提取量為1.70g/L。為了檢驗所得結(jié)果的可靠性,采用優(yōu)化條件進(jìn)行提取試驗,實際測得值為1.72g/L,與理論值相比,0.1%以內(nèi)的相對誤差,因此,響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化條件,灰樹花真菌多糖提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實用價值。

    3 結(jié)論

    在單因素試驗設(shè)計的基礎(chǔ)上,對灰樹花多糖的醇沉條件進(jìn)行了三因素三水平的響應(yīng)面法設(shè)計,從而建立了響應(yīng)值和各個因素之間的數(shù)學(xué)模型,依據(jù)此數(shù)學(xué)模型可以預(yù)測理論提取量。根據(jù)回歸模型確定了灰樹花多糖醇沉的最佳工藝參數(shù):提取溫度11℃、提取時間10.35h、乙醇濃度96%。此條件下,多糖的理論提取量為1.70g/L。采用上述優(yōu)化提取條件進(jìn)行3次提取試驗,實際測得的平均值為1.72g/L,與理論預(yù)測值相比,其相對誤差在0.1%以內(nèi)。因此,利用響應(yīng)面分析方法對灰樹花多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)。

    1 Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential[J].Altern.Med.Rev.,2002(6):6.

    2 馬青,陳石良.灰樹花保健飲料加工工藝研的究[J].食品與機(jī)械,2003(3):22.

    3 孫金旭,朱會霞,李書珍.灰樹花真菌發(fā)酵條件優(yōu)化研究[J].食品與機(jī)械,2009,25(6):131~133.

    4 Ahuja S K,F(xiàn)erreira G M,Moreira A R.Application of Plackett-Burman design and response surface methodology to achieve exponential growth for aggregated shipworm bacterium[J].Biotechnology and Bioengineering,2004(85):666~675.

    Study ongrifola frondosapolysaccharides extracting by response surface method

    SUN Jin-xu ZHUH ui-xia GAO Xiao-kuan LI Shu-zhen

    CHEN Yao LIN Gao-qiangZHOU Cheng-ming

    (Hengshui College,Hengshui,Hebei053000,China)

    The regression model,related to the amount ofgrifola frandosuspolysaccharide extraction,extracting temperature,extracting time,ethanol concentration,was obtained by using Design-Expert experimental design software through quadric regression design.The regression model would be a fairly reliable forecast for extraction ofgrifola frandosuspolysaccharide.The optimized extraction parameters were obtained as follows:extraction temperature 11℃,extraction time 10.35h,ethanol concentration 96%.Under the conditions,the extraction amount ofgrifola frandosuspolysaccharide in theoretically reached 1.70g/L.

    grifola frondosa;response surface;extracting;REPS

    10.3969 /j.issn.1003-5788.2010.05.038

    衡水學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新課題(編號:2010058)

    孫金旭(1975-),男,衡水學(xué)院講師,博士研究生。E-mail:bdsunjinxu@163.com

    2010-05-11

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