酶法提取滸苔多糖工藝優(yōu)化的研究

肖寶石 呂海濤

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東 青島 266109）

酶法提取滸苔多糖工藝優(yōu)化的研究

肖寶石 呂海濤

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東 青島 266109）

以滸苔為原料，研究滸苔多糖的熱水浸提－木瓜蛋白酶聯(lián)合提取工藝。在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用正交試驗設(shè)計，對滸苔多糖的提取條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，提取溫度80℃，提取時間4h，料液比1∶50g/mL，提取2次的條件下，熱水浸提效果最佳。木瓜蛋白酶用量8%，酶解溫度60℃，酶解時間2h，料液pH 5.5的條件下，酶解效果最佳。滸苔多糖得率為27.75%，粗多糖純度為50.03%。

滸苔多糖；木瓜蛋白酶；提?。徽辉囼炘O(shè)計

滸苔（enteromorpha proliferaha）為綠藻門石莼目石莼科植物，廣泛分布于海洋沿岸低潮區(qū)的沙礫、巖石、灘涂和石沼中，也是中國近海常見的一種大型經(jīng)濟藻類。滸苔自古以來即為食用和藥用藻類，含有多種活性功能成分，藥用價值高，開發(fā)潛力大［1］。滸苔多糖是其主要活性成分，存在于藻體細胞中，具有降血脂、抗衰老、增強免疫反應(yīng)、對皮膚癌抑制作用等諸多的生理功能［2－4］。

目前，滸苔多糖的提取常采用水提醇沉法［5－7］，但滸苔中部分多糖是與蛋白結(jié)合的，醇沉?xí)r以糖蛋白的形式沉降，降低了產(chǎn)品的純度。本試驗在熱水浸提的基礎(chǔ)上采用酶法提取滸苔多糖，在多糖浸提過程中加入蛋白酶，可對細胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞作用，將與多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)酶解，使存在于細胞內(nèi)部的多糖更快、更有效地釋放出來，使多糖粗產(chǎn)品具有更高的純度和蛋白質(zhì)脫除率。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

滸苔：采于青島近海。

無水乙醇、濃硫酸、苯酚、葡萄糖：分析純，天津市津東天正精細化學(xué)試劑廠；

木瓜蛋白酶：65萬u/g，廈門星隆達化學(xué)試劑有限公司；

牛血清蛋白：美國Sigma公司；

考馬斯亮藍G－250：上海試劑三廠；

高速組織粉碎機：FW80－1，天津市泰斯特儀器有限公司；

醫(yī)用低速離心機：90－2，江蘇省金壇市恒豐儀器廠；

pH計：Delta320，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；

電子天平：AR2140，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；

紫外可見分光光度計：SP－754，上海光譜儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE－52AA，上海亞榮生化儀器廠；

恒溫水浴鍋：HH－S，江蘇省金壇市金城國際實驗儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取工藝流程

脫脂后滸苔干品→熱水浸提→快速冷卻→調(diào)pH→加酶酶解→酶滅活→過濾，離心→上清液→真空濃縮→乙醇醇沉→沉淀物過濾→濾餅干燥→滸苔粗多糖

1.2.2 材料預(yù)處理 新鮮滸苔用自來水洗凈、干燥至恒重，粉碎，過40目篩，用乙醇在索氏提取器脫脂3次，烘干，備用。

1.2.3 滸苔多糖含量的測定 采用苯酚－硫酸法［8］。稱取干燥至恒重的葡萄糖50.0mg，于50mL容量瓶中加水溶解、定容。量取2.5mL溶液于50mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，制成儲備液。分別吸取上述溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于試管中，加水稀釋至1.0mL，分別加入5%苯酚1mL，混勻，再迅速滴加5mL濃硫酸，振蕩混勻，放置30min，以蒸餾水作為空白，在490nm波長處測定吸光度（A），回歸方程為：c（mg/mL）＝0.004A＋0.013，相關(guān)性系數(shù)為0.996 2。

取粗多糖樣品100mg，溶解，用蒸餾水定容于100mL容量瓶中，搖勻后吸取0.2mL樣液，按照上述方法測定，根據(jù)回歸方程計算多糖濃度，再按式（1）計算多糖提取率。

1.2.4 滸苔多糖蛋白含量的測定 采用考馬斯亮藍法［9］。顯色劑：100mg考馬斯亮藍G－250溶于50mL乙醇，加入100mL 85%H3PO4，蒸餾水定容至1L。準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白250mg溶于蒸餾水，定容至50mL，蛋白濃度為1mg/mL。分別吸出2，4，6，8，10mL定容至100mL，配制成濃度為20，40，60，80，100μg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取1mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入5mL顯色劑，以蒸餾水作空白溶液，振蕩，25℃反應(yīng)10min后在595nm處測吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，蛋白濃度（c）為橫坐標(biāo)作圖，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：c（mg/mL）＝0.005 2A＋0.007 4，相關(guān)性系數(shù)為0.998 5。

將樣品稀釋至適當(dāng)濃度，吸取1mL樣液，按1.2.4操作，在595nm處測定吸光度，按回歸方程計算蛋白含量。

1.2.5 滸苔多糖熱水浸提工藝的優(yōu)化 以時間、溫度、料液比及提取次數(shù)作為考察因素，以滸苔多糖提取率為評價指標(biāo)進行單因素試驗。并在單因素預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計L9（34）正交試驗，以滸苔多糖提取率為評價指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝。

1.2.6 滸苔多糖酶法提取工藝的優(yōu)化 在滸苔多糖熱水浸提最佳提取工藝的基礎(chǔ)上，以木瓜蛋白酶用量、浸提液溫度、pH及酶解時間作為考察因素，以滸苔多糖提取率為評價指標(biāo)進行單因素試驗。并在單因素預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計L9（34）正交試驗，優(yōu)化最佳提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 滸苔多糖熱水浸提工藝的優(yōu)化

通過熱水提取滸苔多糖單因素試驗可得，滸苔多糖提取率隨著溫度的上升而增加，當(dāng)溫度達到80℃時上升趨勢變緩。提取時間在1～4h之間時，多糖提取率隨著時間的延長而增加，在4h時達到最大值；此后，隨著時間的延長，多糖提取率有下降的趨勢，可能是由于高溫下長時間提取會逐漸造成多糖的降解。多糖提取率隨著料液比的增加而升高，料液比為1∶40以后，多糖提取率隨著料液比的增加變化不明顯。多糖提取率隨著提取次數(shù)的增加逐漸升高，超過3次時，提取率逐漸趨于平緩。

根據(jù)單因素實驗確定正交試驗的因素和水平，作L9（34）正交試驗（表1），試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 滸苔多糖熱水提取正交試驗的因素及水平Table 1 Orthogonal experiment factor and level by hot water method

表2 滸苔多糖提取的正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments of extraction of polysaccharide in Enteromorpha

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The square variance analysis result

由表2可知，4個因素對多糖提取的影響程度為：時間＞提取次數(shù)＞料液比＞溫度，其最佳工藝組合為B3A3D3C3，即溫度為100℃，固液比為1∶60（m∶V），時間為4h，提取次數(shù)為3次。由表3可知，各試驗因素對多糖提取效率的統(tǒng)計結(jié)果均無顯著影響?？紤]到實際工業(yè)生產(chǎn)的要求，為縮短生產(chǎn)周期，減小生產(chǎn)成本，選擇最佳工藝條件為B3A2D2C1，即溫度為80℃，固液比為1∶50（m∶V），時間為4h，提取次數(shù)為2次。

為了驗證該試驗結(jié)果，按此工藝條件對滸苔進行提取，重復(fù)3次，多糖平均得率為22.53%，粗多糖純度為46.29%，蛋白含量為0.86%。多糖得率略高于正交試驗組所測得的最高得率，故認為最佳工藝參數(shù)可行。

2.2 滸苔多糖酶法提取工藝的優(yōu)化

通過酶法提取滸苔多糖單因素試驗可得，隨著木瓜蛋白酶用量的增大，多糖提取率逐漸增大。酶用量在8%時，多糖收率最高。酶用量太低，酶解不完全；用量過高，底物被酶分子所飽和，一部分酶分子沒有機會與底物結(jié)合，水解的速度降低，多糖得率不再增加，并且過量蛋白酶的加入也會給后續(xù)蛋白質(zhì)的去除增加困難。最佳酶解pH值為5左右，pH值會影響酶分子側(cè)鏈上極性基團的解離，影響酶空間構(gòu)象，引起酶活性的變化。最適提取溫度是50℃左右。溫度過低，生物酶活性較低；溫度升高可加速反應(yīng)速度，但超過酶最適反應(yīng)溫度會使酶變性失活。隨時間延長酶解程度加深，多糖得率增高；酶解2h時，酶解反應(yīng)基本完全，再延長時間多糖收率增加不明顯。

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以多糖提取率為考察指標(biāo)，設(shè)計正交試驗（表4），正交試驗結(jié)果見表5。

表4 滸苔多糖酶法提取的正交試驗因素水平表Table 4 Orthogonal experiment factor and level by papain method

表5 酶法提取滸苔多糖的正交試驗結(jié)果Table 5 Results of orthogonal experiments of extraction of polysaccharide in Enteromorpha

由表5可知，4個因素對多糖提取的影響程度為：酶解溫度＞pH＞酶用量＞提取時間，其最佳工藝組合為B3A3D3C3，即提取溫度60℃，提取時間4h，酶用量8%，pH 5.5。由表6可知，各試驗因素對多糖提取效率的統(tǒng)計結(jié)果均無顯著影響。考慮到實際生產(chǎn)，最佳工藝條件為A3D3C3B2，即提取溫度60℃，提取時間2h，酶用量8%，pH 5.5。

為了驗證該試驗結(jié)果，按最佳工藝條件進行提取，重復(fù)3次，多糖的平均得率是27.75%，粗多糖純度為50.03%，蛋白含量為0.78%。多糖得率高于正交試驗中的任何一組，說明該工藝穩(wěn)定可行。與單純的滸苔多糖熱水浸提工藝比較，多糖的得率和粗多糖的純度均有提高，蛋白含量降低。

表6 正交實驗方差分析表Table 6 The square variance analysis result

3 結(jié)論

采用木瓜蛋白酶水解滸苔多糖－蛋白復(fù)合物中的蛋白質(zhì)，使存在于細胞內(nèi)部的多糖更快、更有效地釋放出來，不但可以提高多糖的提取效率，而且降低了粗多糖中的蛋白含量，提高了多糖的純度。此外，木瓜蛋白酶較大改善了滸苔樣液的性狀，降低其粘稠度，減少滸苔粗多糖的色素含量，為多糖的后續(xù)純化提供便利條件。

1 林文庭.淺談滸苔的開發(fā)與利用［J］.中國食物與營養(yǎng)，2007（9）：23～25.

2 周慧萍，蔣巡天，陳瓊?cè)A，等.滸苔多糖的降血脂及其對SOD活力和LPO含量的影響［J］.生物化學(xué)雜志，1995（11）：161～165.

3 Kiyoka Hiqashi－Oka，Shuzo Otani，Yasuji Okai.Potent suppressive effect of a Japanese edible seaweed，enteromorpha prolifera（sujiao－nori）on initiation and promotion phases of chemically induced mouse skin tumorigenesis［J］.Cancer Letters，1999（140）：21～25.

4 徐大倫，黃曉春，楊文鴿，等.滸苔多糖的分離純化及其對非特異性免疫功能的體外實驗研究［J］.中國食品學(xué)報，2006，6（5）：17～21.

5 呂玲玲.滸苔水溶性多糖提取工藝的優(yōu)化研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（24）：11 717，11 756.

6 張智芳，林文庭，陳燦坤.滸苔水溶性多糖提取工藝研究［J］.中國食物與營養(yǎng)，2009（3）：39～41.

7 吳明江，焦麗麗，孫永旭，等.滸苔多糖EPIII的分離與鑒定［J］.東北師大學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，39（1）：97～100.

8 蘇撥賢.生物化學(xué)制備技術(shù)［M］.北京：科學(xué)出版社，1986：32～33.

9 張龍翔，張庭芳，孔令媛.生物化學(xué)實驗方法與技術(shù)［M］.第二版.北京：高等教育出版社，1997：136～137.

Optimization on enzymatic extraction of polysaccharides from enteromorpha

XIAO Bao－shiLVHai－tao

（College of Chemistry＆ Pharmacy，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong266109，China）

The extraction technology of enteromorpha polysaccharide by hot water－papain method was investigated through orthogonal test on the basis of single factor experiment.The result showed the optimal extracting conditions by hot water were as follows：Extraction temperature 80 ℃，extraction time 4h，the ratio of solid－liquid 1∶50，and extracting the sample 2times.The optimal extracting conditions by papain were as follows：the amount of papain 8%，enzymolysis temperature 60℃，enzymolysis time 2h，and the pH of extracting media 5.5.Under the optimal extracting conditions，the extraction rate of polysaccharides was 27.75%.The purity of crude polysaccharides was 50.03%.

enteromorpha polysaccharides；papain；extraction；orthogonal test

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.036

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)自然科學(xué)類重點項目（編號：610608）

肖寶石（1985－），男，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：xiaobaoshi2010＠126.com

呂海濤

2010－05－10