影響殼聚糖固定化谷氨酸脫羧酶的因素

姜啟興何 莎張 可于沛沛夏文水

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.空軍航空醫(yī)學(xué)研究所，北京 100142）

影響殼聚糖固定化谷氨酸脫羧酶的因素

姜啟興1何 莎1張 可2于沛沛1夏文水1

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.空軍航空醫(yī)學(xué)研究所，北京 100142）

以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，制備固定化谷氨酸脫羧酶（GAD），并研究固定化反應(yīng)中各個(gè)因素對(duì)固定化GAD活力的影響。結(jié)果表明，殼聚糖固定化谷氨酸脫羧酶的最佳條件為：戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，處理時(shí)間16～24h，處理溫度40℃，酶吸附溫度4℃、酶吸附時(shí)間24h以上，給酶量為70.8mg/g殼聚糖。

殼聚糖；谷氨酸脫羧酶；固定化

γ－氨基丁酸簡(jiǎn)稱GABA，又名4－氨基丁酸、氨酪酸，是腦內(nèi)重要的抑制性物質(zhì)，對(duì)哺乳動(dòng)物心血管活動(dòng)有著重要的調(diào)節(jié)作用［1］。谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）是生物法富集生產(chǎn)GABA的關(guān)鍵酶。目前，發(fā)達(dá)國(guó)家如日本主要利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生GAD進(jìn)而生產(chǎn)GABA，中國(guó)也有相關(guān)研究報(bào)道，但目前微生物法生產(chǎn)GAD的成本普遍較高。近年來(lái)，中國(guó)有很多研究者利用植物中的GAD生產(chǎn)GABA并取得了較好的結(jié)果［2－4］：張暉等研究表明利用廉價(jià)易得的米糠制備GABA是有效可行的；同時(shí)，為了提高米糠中GAD酶的穩(wěn)定性和提高米糠的利用率，對(duì)米糠進(jìn)行固定化也進(jìn)行了研究。

殼聚糖是一種多功能的生物材料，被廣泛用作固定化酶、親和層析、金屬鰲合親和層析的載體［5－6］。本試驗(yàn)直接從米糠中提取GAD粗酶，以殼聚糖為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，對(duì)影響殼聚糖固定化谷氨酸脫羧酶的因素進(jìn)行研究，為進(jìn)一步優(yōu)化米糠生產(chǎn)GABA工藝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與設(shè)備

殼聚糖：脫乙酰度85%，濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司；

巰基乙醇：98%，Janssen Chimica公司；

25%戊二醛水溶液、磷酸吡哆醛、丙三醇、冰醋酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉等：均為分析純，中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；

電子天平：AB104－N，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；

分光光度計(jì)：722型，上海精密科學(xué)儀器廠；

電熱恒溫水浴鍋：HH－2，常州國(guó)華電器有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101－A，通州市制藥設(shè)備廠；

冷凍離心機(jī)：4K－15，德國(guó)Sigma公司；

微型漩渦混合儀：WH－2，上海滬西分析儀器廠有限公司；磁力攪拌器：79－Ⅰ型，江蘇江陰科研器械廠；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB－B95型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；

多功能食品加工機(jī)：SQ2119，上海帥佳電子科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 GAD粗酶提取液的制備 取細(xì)米糠200g，加入提取液 1 000mL（50mmol/L 磷 酸 鉀 緩 沖 液，pH 5.6，2mmol/L 巰基乙醇，2mmol/L EDTA，1mmol/L PLP和體積分?jǐn)?shù)10%的甘油），用高速分散器打成勻漿，6層紗布過(guò)濾，4℃下離心10min（12 000r/min），離心2次。上清液即為GAD粗酶提取液，粗酶提取液活力為2.5U/mL。

1.2.2 固定化GAD的制備 稱取適量珠狀殼聚糖，加入一定濃度的戊二醛水溶液20g，磁力攪拌均勻，一定溫度下靜置過(guò)夜，用pH 5.6的磷酸鉀緩沖液抽洗至濾液中檢測(cè)不到戊二醛存在（230nm下檢測(cè)無(wú)吸收峰），然后加入20mL粗酶提取液（于細(xì)米糠中提取所得），攪拌均勻后在一定溫度下靜置過(guò)夜，用pH 5.6的緩沖液抽洗至濾液中檢測(cè)不到蛋白質(zhì)存在（茚三酮反應(yīng)無(wú)色），即得固定化GAD。

1.2.3 固定化GAD與游離GAD酶活測(cè)定 用測(cè)定GABA生成量的方法計(jì)算酶活力。以1.0%L－谷氨酸溶液為底物（用pH 5.6PBS緩沖液配制），加入一定量的GAD粗酶提取液或固定化GAD于40℃水浴中保溫2h，取酶反應(yīng)液0.4mL，加入 Na2CO3（1mol/L）0.1mL、pH 10.0硼酸鹽緩沖液（0.2mol/L）0.5mL、6% 苯酚1mL，混勻，于室溫下（20℃）5min內(nèi)加入5.2%NaClO溶液1mL，混勻后放置4～8min，然后沸水浴10min，立即冰浴20min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后，加入2.0mL 60% 乙醇溶液，混勻后測(cè)定640nm處的吸收值。

根據(jù)測(cè)得的吸光度，結(jié)合GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)應(yīng)到其質(zhì)量濃度上，換算成相應(yīng)的質(zhì)量，除以GABA的分子量（103.12），再除以參與反應(yīng)的粗酶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量或固定化GAD質(zhì)量，以每克酶每30min生成1μmol GABA作為一個(gè)酶活力單位U。固定化GAD酶活回收率按式（1）計(jì)算：

1.2.4 固定化酶工藝

（1）戊二醛濃度對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響：稱取適量珠狀殼聚糖，分別加入20g 0.25%，0.5%，1.0%，2.0%，3.0%，5.0%，7.0%的戊二醛水溶液，磁力攪拌均勻，4℃冰箱中靜置過(guò)夜，用pH 5.6的緩沖液抽洗至濾液中無(wú)戊二醛存在（230nm下檢測(cè)無(wú)吸收峰），然后加入20mL粗酶提取液，攪拌均勻后于4℃冰箱中靜置過(guò)夜，用pH 5.6的緩沖液抽洗至濾液中無(wú)蛋白質(zhì)存在（茚三酮反應(yīng)無(wú)色），即得固定化GAD。分別測(cè)定所得固定化GAD的酶活回收率，比較分析戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響。

（2）戊二醛交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響：稱取適量珠狀殼聚糖，加入20g 3%的戊二醛水溶液，磁力攪拌均勻，4℃冰箱中分別靜置4，8，12，16，20，24，48h，其他步驟同1.2.4（1）。

（3）戊二醛處理溫度對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響：稱取適量珠狀殼聚糖，加入20g 3%的戊二醛水溶液，磁力攪拌均勻，分別于4，25，40，50℃下保溫靜置16h，其他步驟同1.2.4（1）。

（4）酶固定溫度對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響：稱取適量珠狀殼聚糖，加入20g 3%的戊二醛水溶液，磁力攪拌均勻，4℃冰箱中靜置16h，用pH 5.6的緩沖液抽洗至濾液中無(wú)戊二醛存在（230nm下檢測(cè)無(wú)吸收峰），然后加入20mL粗酶提取液，攪拌均勻后分別于4，25，30，35，40℃水浴中靜置過(guò)夜，其他步驟同1.2.4（1）。

（5）酶固定時(shí)間對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響：稱取適量珠狀殼聚糖，加入20g 3%的戊二醛水溶液，磁力攪拌均勻，4℃冰箱中靜置16h，用pH 5.6的緩沖液抽洗至濾液中無(wú)戊二醛存在（230nm下檢測(cè)無(wú)吸收峰），然后加入20mL粗酶提取液，攪拌均勻后分別在4℃冰箱中靜置8，12，18，24，32，48h，其他步驟同1.2.4（1）。

（6）粗酶液用量（蛋白質(zhì)用量）與殼聚糖用量之比對(duì)固定化 GAD酶活回收率的影響：分別稱取1，5，7，8，10，12g珠狀殼聚糖，其他步驟同1.2.4（1）。

2 結(jié)果與討論

2.1 GABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)定的GABA回歸方程為y＝0.295x＋0.010，R2＝0.996 0。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of GABA

2.2 戊二醛濃度對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響

由于戊二醛既是交聯(lián)劑，又是酶的變性劑，因此在制備固定化GAD反應(yīng)過(guò)程中，戊二醛的用量對(duì)固定化酶的活力具有顯著的影響。在其他條件不變的情況下，改變戊二醛用量，制備固定化GAD，測(cè)定其相對(duì)活力，得到不同戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化GAD酶活回收率影響的關(guān)系圖（見(jiàn)圖2）。

圖2 戊二醛濃度對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響Figure 2 Effect of glutaraldehyde concentration on recovery rate of immobilized GAD enzyme activity

由圖2可知，隨著戊二醛濃度的增加，酶活回收率呈先增后減的趨勢(shì)。當(dāng)戊二醛濃度低于3%時(shí)，固定化GAD的酶活回收率隨戊二醛濃度的增加而上升，這是因?yàn)殡S著戊二醛濃度的增加，與殼聚糖氨基結(jié)合的醛基數(shù)量增加，相應(yīng)固定化GAD的量也逐漸增加，因而酶活力也增加。戊二醛濃度超過(guò)3%時(shí)，由于殼聚糖結(jié)合過(guò)多的活性醛基，導(dǎo)致酶活性中心受到過(guò)多的醛基進(jìn)攻，使酶失活，固定化GAD的活力下降。因此，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的戊二醛溶液制得的固定化GAD效果最好，此時(shí)酶活回收率達(dá)11.93%。

2.3 戊二醛交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響

戊二醛交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著交聯(lián)時(shí)間的增加，固定化GAD的活力先迅速增加后又緩慢降低最后趨于平緩。戊二醛交聯(lián)時(shí)間在16～24h范圍內(nèi)，得到的固定化GAD酶活回收率都在11%以上。這主要是由于交聯(lián)時(shí)間越長(zhǎng)，與殼聚糖交聯(lián)的戊二醛的量越多，固定化的酶量也越多，因而酶活越高。而繼續(xù)延長(zhǎng)交聯(lián)時(shí)間，殼聚糖結(jié)合過(guò)多的戊二醛，酶活性中心受到過(guò)多的醛基進(jìn)攻，使酶失活，固定化GAD的活力稍有下降。故最適交聯(lián)時(shí)間為16h，此時(shí)酶活回收率為11.96%。

圖3 戊二醛交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響Figure 3 Effect of glutaraldehyde crosslinking time on recovery rate of immobilized GAD enzyme activity

2.4 戊二醛處理溫度對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響

戊二醛處理溫度對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 戊二醛處理溫度對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響Figure 4 Effect of glutaraldehyde processing temperature on recovery rate of immobilized GAD enzyme activity

由圖4可知，隨著溫度的升高，固定化GAD的酶活回收率呈先增后減的趨勢(shì)，處理溫度為40℃左右時(shí)制得的固定化GAD酶活回收率最大，為15.36%，而在4℃時(shí)的酶活回收率最低。這可能是由于戊二醛與殼聚糖反應(yīng)時(shí)伴隨著能量變化，在40℃比較有利于該反應(yīng)。因此，戊二醛交聯(lián)殼聚糖的最適溫度為40℃左右。

2.5 酶固定溫度對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響

GAD非常容易失活，酶的固定化溫度直接影響了固定化酶的酶活回收率。酶固定溫度對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 酶固定溫度對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響Figure 5 Effect of immobilization temperature on recovery rate of immobilized GAD enzyme activity

由圖5可知，隨著處理溫度的升高，其酶活回收率迅速降低；4℃冰箱中處理得到的固定化GAD酶活回收率最大，為12.22%；40℃時(shí)則基本失活。這主要是由于在較高的溫度下，游離GAD很快失活，而在低溫下GAD的酶活得到較好的保持，并經(jīng)固定化后提高了其穩(wěn)定性。因此，酶固定化的最適溫度為4℃。

2.6 酶固定時(shí)間對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響

酶固定時(shí)間對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 酶固定時(shí)間對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響Figure 6 Effect of immobilization time on recovery rate of immobilized GAD enzyme activity

由圖6可知，隨著酶固定時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化GAD的酶活回收率也隨之不斷增加。當(dāng)酶吸附時(shí)間在24h以上時(shí)，其酶活回收率都在16%以上，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，酶活回收率的增長(zhǎng)趨勢(shì)減緩。這是由于時(shí)間越長(zhǎng)，殼聚糖上固定的酶越多，因此固定化GAD的酶活回收率也越高。

2.7 給酶量對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響

給酶量對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響見(jiàn)圖7。

圖7 給酶量對(duì)固定化GAD酶活回收率的影響Figure 7 Effect of enzyme concentration on recovery rate of immobilized GAD enzyme activity

由圖7可知，固定化GAD的活力，最初隨給酶量增加而升高，隨后又迅速降低，當(dāng)每克殼聚糖載體固定蛋白質(zhì)的量為70.8mg時(shí)，固定化GAD的活力最大，其酶活回收率達(dá)到22.38%。

3 結(jié)論與展望

本研究以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，利用殼聚糖微球制備固定化的GAD。研究發(fā)現(xiàn)，戊二醛濃度、戊二醛處理時(shí)間、戊二醛處理溫度、酶吸附溫度、酶吸附時(shí)間及給酶量等因素均能顯著影響GAD的固定化；殼聚糖微球與戊二醛交聯(lián)的最佳工藝條件為：戊二醛濃度3%，戊二醛處理時(shí)間16～24h，戊二醛處理溫度40℃；固定化酶的最佳條件為：酶吸附溫度4℃，酶吸附時(shí)間24h以上，給酶量70.8mg/g殼聚糖，酶活回收率達(dá)到22.38%。

本試驗(yàn)中固定化所用的GAD為提取的粗酶液，粗酶液中含有可溶性糖、鹽、雜蛋白等雜質(zhì)，對(duì)固定化的干擾較大，另外GAD本身穩(wěn)定性較差，極易失活，從而導(dǎo)致本試驗(yàn)的酶活回收率相對(duì)較低。因此今后研究中應(yīng)將GAD初步分離純化后再進(jìn)行固定化，同時(shí)應(yīng)考慮GAD的活性保護(hù)措施；另外本試驗(yàn)過(guò)程中未考慮殼聚糖的脫乙酰度、相對(duì)分子量、pH等因素的影響。通過(guò)對(duì)上述因素深入研究有望進(jìn)一步提高固定化GAD的酶活回收率。

1 王來(lái)儀.γ－氨基丁酸、受體藥理學(xué)及對(duì)心血管活動(dòng)的調(diào)節(jié)［J］.心血管學(xué)報(bào)，1991，10（1）：46～49.

2 陳穎，沈艷，姚惠源.米糠γ－氨基丁酸富集工藝的研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2005（4）：5～7.

3 張暉.米胚谷氨酸脫羧酶性質(zhì)及其富集γ－氨基丁酸研究［D］.無(wú)錫：江南大學(xué)，2004.

4 王筱婧，王立，馬曉博，等.利用海藻酸鈉固定化米糠制備γ－氨基丁酸的研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30（4）：222～224.

5 陳星河，曾超，米運(yùn)宏，等.殼聚糖在固定化GAD載體上的應(yīng)用［J］.廣西輕工業(yè)，2007（8）：18～19，31.

6 林少琴，吳若紅.殼聚糖固定谷氨酸脫梭酶的研究［J］.藥物生物技術(shù)，2005，12（2）：101～105.

Effect of factors on chitosan immobilized glutamate decarboxylase

JIANG Qi－xing1HE Sha1ZHANG Ke2YU Pei－pei1XIAW en－shui1

（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu214122，China；2.Instute of Aviation Medicine Air Force，Beijing100142，China）

Glutamate decarboxylase（GAD）in rice bran was immobilized with chitosan using glutaraldehyde as crosslinking agent.The influence of each factor in the immobilization was studied on the activity of immobilized GAD.The results show that the best condition of immobilization of glutamate decarboxylase with chitosan were：3%glutaraldehyde solution，processing time for 16～24h，treatment temperature is 40 ℃，enzyme adsorption temperature is 4 ℃，enzyme adsorption time over 24h，amount to enzyme to chitosan 70.8mg/g.

chitosan；glutamate decarboxylase（GAD）；immobilization

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.005

江南大學(xué)食品學(xué)院青年博士基金課題（編號(hào)：FS－200810）

姜啟興（1977－），男，江南大學(xué)講師，博士研究生。E－mail：qixingj＠163.com

夏文水

2010－05－21