人載脂蛋白A5單抗制備及臨床應(yīng)用的研究

焦娟 趙滿倉(cāng) 魏文青 劉晶 張艷 付瑤

·論著·

人載脂蛋白A5單抗制備及臨床應(yīng)用的研究

焦娟 趙滿倉(cāng) 魏文青 劉晶 張艷 付瑤

目的制備抗人載脂蛋白A5(ApoA5)單克隆抗體(McAb)，建立ELISA雙抗體夾心法，并進(jìn)行初步的臨床應(yīng)用。方法利用合成的人ApoA5抗原免疫BALB/c小鼠，制備McAb，并對(duì)抗體的效價(jià)、特異性、亞類及位點(diǎn)進(jìn)行了測(cè)定，建立了ELISA雙抗體夾心法，測(cè)定了正常對(duì)照組(145例)和冠心病組(68例)血清中ApoA5的含量。結(jié)果獲得了5個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，且均為IgG2a型。腹水效價(jià)達(dá)到1.6×105。冠心病組膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和ApoB水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)、ApoA1和ApoA5水平明顯低于對(duì)照組(P< 0.05)。ApoA5與HDL-C、ApoA1水平呈正相關(guān)(r值分別為0.53和0.63，P<0.05)，與TC、TG、LDL-C、ApoB呈負(fù)相關(guān)(r分別為－0.69、－0.63、和－0.59，P<0.05)。結(jié)論ApoA5參與脂質(zhì)代謝，對(duì)于心血管疾病的預(yù)防和治療具有一定的臨床意義。

載脂蛋白A類;抗體，單克隆;血脂;冠心病

載脂蛋白A5(apolipoprotein A5，ApoA5)是由Vander等［1，2］在2001年同期發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的一個(gè)載脂蛋白家族新成員，其參與調(diào)節(jié)血脂代謝，尤其與三酰甘油(TG)關(guān)系密切，是與血漿TG水平呈負(fù)相關(guān)的載脂蛋白。血漿TG水平升高是動(dòng)脈粥樣硬化和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)的重要危險(xiǎn)因素，高TG血癥已被列為冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。探討ApoA5與高脂血癥的相互關(guān)系，對(duì)于心血管疾病的預(yù)防和治療具有重要的理論和實(shí)際意義。我們利用生物技術(shù)合成ApoA5，偶聯(lián)載體蛋白制成抗原，免疫BALB/c小鼠，制備抗人ApoA5單克隆抗體。建立ApoA5－ELISA雙抗體夾心法，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和影響因素進(jìn)行了探索，并初步應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2007年9月至2008年11月門診體正常人145例作為正常對(duì)照組，男87例，女58例;年齡38～78歲，平均年齡60歲。選擇同期我院心內(nèi)科確診的冠心病的患者68例(參考1979年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn))作為冠心病組，男42例，女26例;年齡41～83歲，平均年齡(61±8)歲。2組性別比、年齡間有均衡性。

1.2 試驗(yàn)材料 BALB/c小鼠，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;SP2/0細(xì)胞株，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所惠贈(zèng);弗氏佐劑，本實(shí)驗(yàn)室自制;ApoA5抗原，由北京博奧森生物技術(shù)有限公司合成;羊抗鼠-HRP購(gòu)自博奧森生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)，Sigma產(chǎn)品。ApoA1、ApoB抗原由衛(wèi)生部北京老年醫(yī)學(xué)研究所惠贈(zèng)。TG、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、ApoA1、ApoB試1盒、全自動(dòng)生化分析儀均為羅氏公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物免疫:用常規(guī)免疫法免疫BALB/c小鼠，第1次用完全佐劑，第2、3次用不完全佐劑，第4次由脾臟直接注射。

1.3.2 抗ApoA5單克隆抗體(McAb)的制備:①細(xì)胞融合:取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在50%聚乙二醇(PEG)的作用下8∶1比例進(jìn)行融合，10 d后檢測(cè)抗體，選取陽(yáng)性孔，采用有限稀釋法克隆化，待克隆陽(yáng)性率100%時(shí)，擴(kuò)大培養(yǎng)，制備腹水。②抗體特異性測(cè)定:固相載體分別包被ApoA5、ApoA1、ApoB和人血清白蛋白，用ELISA法測(cè)定。抗體的Ig及亞類鑒定采用雙相免疫擴(kuò)散法。③抗體的效價(jià)測(cè)定:取上清和腹水，用0.9%氯化鈉溶液稀釋成不同濃度，用ELISA法測(cè)定其效價(jià)。

1.3.3 ApoA5 ELISA測(cè)定方法的建立:利用制備的 ApoA5 McAb，建立ELISA雙抗體夾心法，并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。利用棋盤滴定的方法對(duì)包被抗體的濃度、血清稀釋倍數(shù)、酶標(biāo)抗體的稀釋倍數(shù)進(jìn)行了選擇。

1.3.4 其他生化指標(biāo)測(cè)定:TG、TC、HDL-C、LDL-C采用酶法測(cè)定;ApoA1、ApoB采用免疫比濁法用羅氏全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以ˉx±s表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗人ApoA5單克隆抗體的制備及免疫學(xué)分析 按常規(guī)法免疫，取小鼠眼睛血，經(jīng)檢測(cè)效價(jià)為1∶64。取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，篩選出陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞株5個(gè)，分別命名為A51、A52、A53、A54和A55。經(jīng)檢測(cè)，陽(yáng)性細(xì)胞株上清效價(jià)達(dá)到1∶256;腹水效價(jià)達(dá)到1.6×105;5株McAb與ApoA5特異性反應(yīng)，與ApoA1、ApoB和人血清白蛋白均無交叉反應(yīng)，說明各McAb是高度特異的;5株McAb均為IgG2a。

2.2 ELISA方法的建立 利用棋盤滴定的方法對(duì)包被抗體的濃度、血清稀釋倍數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線和酶標(biāo)抗體的稀釋倍數(shù)進(jìn)行了選擇。結(jié)果表明當(dāng)包被抗體濃度為1∶800，酶標(biāo)抗體濃度為1∶400，血清稀釋倍數(shù)為1∶200時(shí)曲線效果最佳。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立 ApoA5-ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。ApoA5濃度在10.0～320.0 μg/L范圍內(nèi)，曲線線性關(guān)系良好。本法測(cè)定的靈敏度為2.0 μg/L。

2.4 臨床應(yīng)用 冠心病組TC、TG、LDL-C和ApoB水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而HDL-C、ApoA1和ApoA5水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。結(jié)果表明，ApoA5與HDL-C、ApoA1水平呈正相關(guān)(r值分別為0.53和0.63)，與TC、TG、 LDL-C、ApoB呈負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為 －0.69、－0.63和－0.69)。

圖1 ApoA5測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

研究表明，ApoA5基因多態(tài)性中少見等位基因與血清TG增加有關(guān)［3-7］。同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明ApoA5在體內(nèi)TG代謝過程中發(fā)揮重要作用，敲除ApoA5基因小鼠的血漿TG水平約是正常對(duì)照的4倍，同時(shí)伴有極低密度脂蛋白(VLDL)的升高;相反，轉(zhuǎn)入人ApoA5基因的小鼠，其血漿TG水平下降66%，VLDL亦有下降;這些表明ApoA5表達(dá)與TG呈高度負(fù)相關(guān)［1，2］。因此，制備高效、特異的抗ApoA5單抗對(duì)于心血管疾病的診斷和治療具有良好的應(yīng)用前景。

本研究利用ApoA5引物，擴(kuò)增出ApoA5 cDNA的全長(zhǎng)編碼序列和C端序列，將其連接到pQE30載體上，獲得了全長(zhǎng)和片段His融合蛋白，純化復(fù)性后得到高純度的ApoA5蛋白。以它為抗原通過雜交瘤技術(shù)建立了雜交瘤細(xì)胞株，成功制備出了鼠源性的抗ApoA5的單抗。經(jīng)特異性測(cè)定表明，單抗僅與純化的ApoA5反應(yīng)，與其他抗原無交叉反應(yīng)，表明抗ApoA5的單抗具有較高的特異性。

在抗體的制備過程中，我們發(fā)現(xiàn)有很多因素影響了單抗的效價(jià)和特異性。首先，人ApoA5與小鼠ApoA5具有高度的同源性，可達(dá)到70%以上，這就增加了制備ApoA5鼠源單抗的難度。因?yàn)榈鞍椎耐葱栽礁?，在生物體內(nèi)產(chǎn)生有效免疫的可能性越低，從而不產(chǎn)生抗體或產(chǎn)生的抗體很少。其次，抗原的濃度也很關(guān)鍵。如果抗原濃度太低，動(dòng)物也不會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。我們就需要加大抗原濃度或增加免疫次數(shù)。另外，通過基因工程合成的抗原，雖然有效解決了由于天然蛋白含量少而不利于研究的問題，但是合成的抗原畢竟是在原核生物中產(chǎn)生的，其結(jié)構(gòu)很可能與體內(nèi)蛋白的結(jié)構(gòu)不完全一致，從而不能高度有效的檢測(cè)人體內(nèi)的ApoA5，達(dá)不到預(yù)期的理想效果。因此，關(guān)于抗ApoA5 McAb在臨床上的應(yīng)用，將另文報(bào)道。

表1 2組血脂檢測(cè)結(jié)果比較±s

表1 2組血脂檢測(cè)結(jié)果比較±s

注:與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，#P<0.01

組別 TC(mmol/L) TG(mmol/L) HDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L) ApoA1(g/L) ApoB(g/L) ApoA5(μg/L)正常對(duì)照組(n=145) 4.3±0.7 1.4±0.6 1.2±0.4 2.9±0.8 1.3±0.3 1.0±0.4 74±10冠心病組(n=68) 5.2±1.0* 1.8±0.8* 0.8±0.6* 3.8±0.9# 0.9±0.3# 1.8±0.8# 62±10*

在ApoA5 ELISA建立過程中，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇包被抗體濃度為1∶800，酶標(biāo)抗體濃度為1∶400，血清稀釋倍數(shù)為1∶200。標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量范圍10.0～320.0 μg/L，測(cè)定的靈敏度為2.0 μg/L。該方法初步應(yīng)用于臨床，正常對(duì)照組和冠心病組血清ApoA5水平分別為(74±10)和(62±10)μg/L，冠心病患者的ApoA5水平明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)。通過ApoA5與脂質(zhì)相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，ApoA5與HDL-C、ApoA1組呈正相關(guān)，與TC、TG、LDL-C、ApoB呈負(fù)相關(guān)。表明ApoA5參與脂質(zhì)代謝，對(duì)于高脂血癥有潛在的調(diào)節(jié)作用。

1 Vander Vliet HN，Sammels MG，Leegwater AJ，et al.Apolipoprotein A-V: a novel apolipoprotein associated with an early phase of liver regeneration.J Biol Chem，2001，276:44512-44520.

2 Pennacchio LA，Olivier M，Hubacek JA，et al.An apolipoprotein influencing triglycerides in humans and mice revealed by comparative sequencing.Science，2001，294:169-173.

3 Pennacchio LA，Olivier M，Hubacek JA，et al.Two independent Apolipoprotein A5 haplotypes influence human plasma triglyceride levels.Hum Mol Genet，2002，11:3031-3038.

4 Talmud PJ，Martin S，Taskinen MR，et al.APOAS gene variants，lipoprotein particle distribution，and progression of coronary heart disease:results from the LOCAT study.J Lipid Res，2004，45:750-756.

5 畢楠，鄢盛愷，李國(guó)平，等.冠心病患者載脂蛋白A5和載脂蛋白C3基因多態(tài)性的研究.中華心血管雜志，2005，33:116-121.

6 Austin MA，Talmud PJ，F(xiàn)arin FM，et al.Association of apolipoprotein A5 variants with LDL particle size and triglyceride in Japanese Americans. Biochim-Biophys-Acta，2004，1688:1-9.

7 Kao JT，Wen HC，Chien KL，et al.A novel genetic variant in the Apolipoprotein A5 gene is associated with hypertriglyceridemia.Hum Mol Genet，2003，12:2533-2539.

Preparation and characterization of monoclonal antibodies against human apolipoprotein A5 and its clinical application

JIAO Juan，ZHAO Mancang，WEI Wenqing，et al.Department of Central Laboratory，General Hospital of Beijing Military Command，Beijing100700，China

ObjectiveTo prepare the monoclonal antibodies against human apolipoprotein A5(ApoA5)，and to establish a double antibody sandwich enzyme-linked immunoassay for the clinical detection of human ApoA5.MethodsThe BALB/c mice were immunized with recombinant ApoA5 to prepare the McAb.The antibody titers，specificity，subclass and antigenic determinants of the McAb were identified and measured.The serum ApoA5 levels of 145 healthy people and 68 patients with CHD were detected by ELISA.ResultsFive hybridoma cell lines secreting McAb against human ApoA5 were obtained，they were highly specific to ApoA5 and all belonged to the subtypes of IgG2a.The ascites titer reached 1.6×105.The levels TC，TG，LDL-C and ApoB in CHD group were significantly higher than those in control group(P<0.05)，however the levels of HDL-C，ApoA1 and ApoA5 in CHD group were significantly lower than those of control group(P<0.05).ConclusionThe APOA5 levels are positively related to HDL-C，ApoA1 levels，however，which are negatively correlated with TC，TG，LDL-C，ApoB levels.To explore the exact relationship between ApoA5 levels and hyperlipidemia may have potential clinical significance in prevention and treatment of cardiovascular diseases.

apolipoprotein A5;monoclonal antibodies;serum lipid;coronary heart disease

R 589.21

A

1002－7386(2010)03－0264－03

100700 北京市，中國(guó)人民解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)科

趙滿倉(cāng)，100700 中國(guó)人民解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院; E-mail:zhaomc456@163.com

2009－08－12)