超聲波、微波對鮭魚肽結(jié)構(gòu)及抗氧化性的影響

康永鋒，康俊霞，吳文惠，史華進(jìn)

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306; 2.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)研究院，上海201306)

膠原蛋白(collagen)主要存在于動物的結(jié)締組織，被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、美容、食品、化工、照相、材料、飼料等行業(yè)［1］。由于酶法水解制備多肽條件溫和易于控制、專一性強(qiáng)、副產(chǎn)物少、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于肽類的研究中［2-3］。但是酶解反應(yīng)僅在普通水浴中進(jìn)行，需要較長的酶解時(shí)間，易使蛋白質(zhì)變性，酶解的效率低。而利用微波或者超聲波等物理手段輔助酶解蛋白獲得多肽，可以大大縮短酶解時(shí)間，提高酶解效率，但是對其作用機(jī)理的研究處于起步階段。2002年Xuejun Pan等［4］通過對微波輔助提取與普通加熱回流提取進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)微波輔助提取不僅可以節(jié)約時(shí)間而且可以提高提取率。2005年羅昭鋒等［5］報(bào)道了超聲波對牛血清白蛋白結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)超聲使 BSA嚴(yán)重聚集。2012年 Rohit Upadhyay等［6］研究發(fā)現(xiàn)微波輔助提取綠原酸不僅可增加其得率，而且對其超氧陰離子自由基清除能力有影響。2010年Conti等［7］通過紅外掃描研究了超聲波對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)超聲波處理后被測樣品的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。不同來源膠原蛋白肽其成分和氨基酸組成不同，對海洋生物來源的膠原肽的研究尚處于初級階段。對于鮭魚魚皮膠原肽(Salmon skin Peptide，SSP)的抗氧化性的研究還未見報(bào)道。另外超聲波、微波對SSP氨基酸組成及結(jié)構(gòu)的影響還未見報(bào)道。本文研究了超聲波、微波對SSP抗氧化性的影響，通過紫外、紅外光譜掃描及氨基酸組成分析對其結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行了探討。為進(jìn)一步對SSP活性物質(zhì)研究提供了理論依據(jù)，同時(shí)為膠原肽改性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮭魚膠原蛋白(Salmon collagen，SC) 武漢天天好有限公司提供;Tris-HCl上海浩然生物技術(shù)有限公司提供;堿性蛋白酶 龐博生物科技有限公司提供;L-色氨酸 上海國藥化學(xué)試劑有限公司提供;所有其他試劑均為分析純。

L-8800氨基酸自動分析儀日本日立公司;差示掃描量熱儀 美國梅特勒公司;紫外可見分光光度計(jì)UV-2450 島津國際貿(mào)易有限公司;紅外分光光度計(jì)FTIR 1650 美國珀金埃爾默公司;熒光分光光度計(jì)970CRT 蘇州江東精密儀器有限公司;臺式PH計(jì)S20 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán);電腦微波超聲波組合催化合成/萃取儀XH-300A 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;真空冷凍干燥機(jī)FD-80 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鮭魚膠原蛋白熱穩(wěn)定性的測定 使用高靈敏度的差示量熱掃描儀(METTLER TOLEDO STARe系統(tǒng)DSC822e)，其溫度準(zhǔn)確性為±0.1℃，量熱靈敏度: 0.04mW(FRS5)/0.01mW(HSS7)，溫度范圍:-150～700℃，升溫速率:0.01～300℃/m in。使用前用銦進(jìn)行單點(diǎn)溫度校準(zhǔn)，純氮?dú)庾鳛檩d氣，流速50m L/m in。在起始溫度為20℃，終止溫度為200℃，溫度變化率為10℃/m in的條件下進(jìn)行DSC掃描。

1.2.2 超聲波、微波對SSP抗氧化性的影響

1.2.2.1 SSP的制備 用去離子水配制濃度為5mg/m L的鮭魚膠原蛋白溶液。調(diào)節(jié)到酶的最適pH8.2，然后分成4份，分別加入堿性蛋白酶，酶解溫度45℃，先放入45℃的水浴中酶解5m in，然后放入超聲波催化合成/萃取儀中，一份在超聲功率100W，41℃超聲處理10m in，一份在微波功率500W，41℃條件下微波處理10m in，一份在超聲波功率100W，微波功率500W的條件下處理10min。剩下的一份常規(guī)加熱酶解作為對照。加酶2h后，離心分離，取上清液為抗氧化肽粗品，檢測其超氧陰離子自由基的清除率。用冷凍干燥機(jī)FD-80將其分別冷凍干燥，作為SSP凍干粉待用。

1.2.2.2 超氧陰離子自由基清除能力的檢測 取0.5mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.2)5m L，置于25℃水浴中預(yù)熱20m in，分別加入1m L配好的樣品蛋白溶液5mg/m L再加3.7m L去離子水和0.3m L 3mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中，以HCl為空白，在327nm下測定其吸光度。

式中:A0為空白的吸光度值，Ai為樣品的吸光度值。

1.2.3 超聲波、微波對SSP結(jié)構(gòu)的影響

1.2.3.1 SSP紫外光譜特性研究 將制備的SSP凍干粉樣品溶解于0.5mol/L醋酸溶液中，分別配制成2g/L溶液，用UV-2450紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描。測試前先進(jìn)行基線校正來設(shè)定當(dāng)前選擇的波長范圍內(nèi)的背景為零。然后將樣品放入1cm石英比色皿中，設(shè)定波長間隔為0.5nm，以相應(yīng)溶劑0.5mol/L醋酸溶液為空白，在200～400nm近紫外光區(qū)進(jìn)行快速掃描測試。

1.2.3.2 SSP紅外光譜特性研究 將制備的SSP凍干粉與KBr壓片，在500～4000cm-1范圍內(nèi)用FTIR 1650掃描。

1.2.4 SSP氨基酸組成測定

1.2.4.1 SSP水解后氨基酸組成分析 稱取制備的SSP凍干粉 0.050g放于 30m L水解管中，加入6.0mol/L的HCl溶液20m L，參照GB/T14965-1994《食品中氨基酸測定方法》［8］進(jìn)行水解。水解液冷卻后移入25m L容量瓶，用去離子水定容后取出2m L于10m L容量瓶中在真空干燥箱中45℃干燥，用0.02mol/L的鹽酸溶解定容，用0.20μL的水系微孔濾膜過濾后，供氨基酸自動分析儀測定用。

1.2.4.2 SSP游離氨基酸組成分析 準(zhǔn)確稱SSP凍干粉0.010g，加入磺基水楊酸去蛋白離心取上清液，用0.02mol/L的鹽酸溶解，定容至 50m L，然后用0.20μL的水系微孔濾膜過濾，供氨基酸自動分析儀測定用。

1.2.4.3 SSP水解后色氨酸的測定 配制1mg/m L的色氨酸樣本母液，然后稀釋為40、0.8、0.48μg/m L系列，各取1m L與樣品管在相同條件下，同時(shí)水解。水解液冷卻后，于10m L容量瓶中，用pH11的4mol/L尿素溶液定容至刻度［9］。掃描方式:靈敏度:1，EX的狹縫寬度:20nm，EM的狹縫寬度:10nm，發(fā)射波長EM為360nm，激發(fā)波長EX為210～420nm的范圍內(nèi)快速掃描，確定其激發(fā)波長。然后再將樣本母液逐級稀釋為0.8、0.48、0.32、0.16、0.08μg/m L的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列。測定水解后各色氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列的INT值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定SSP水解后色氨酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白熱穩(wěn)定性的研究

膠原蛋白螺旋的穩(wěn)定性依賴于分子間和分子內(nèi)各種作用的協(xié)同效應(yīng)，在某些物理或化學(xué)因素作用下，其特定的空間結(jié)構(gòu)容易被破壞，即破壞其三股螺旋的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的改變。當(dāng)溫度升高到膠原蛋白的熱變性溫度以上的時(shí)候，膠原蛋白吸收能量超過分子間作用力時(shí)，分子中的氫鍵結(jié)構(gòu)發(fā)生變形，溶劑水分子作為氫鍵的受體或供體，與蛋白質(zhì)分子骨架及側(cè)鏈上的基團(tuán)競爭形成氫鍵，最終導(dǎo)致膠原蛋白三股螺旋鏈被破壞，使得包埋在膠原蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露出來，易于聚集、變性，膠原蛋白鏈從伸展的纖維狀態(tài)轉(zhuǎn)變成無規(guī)則卷曲狀態(tài)［10-11］。

從圖1觀察，在升溫過程中鮭魚膠原蛋白有兩個(gè)吸熱峰:從47.08℃至52.04℃時(shí)，有一個(gè)吸熱過程熱焓發(fā)生變化ΔΗ為正，對溫度敏感，膠原蛋白發(fā)生熱變性，其熱變性溫度為50.5℃。第二個(gè)吸熱峰位于103.8℃處，這是熱變性后的膠原蛋白進(jìn)一步升溫后熔融的溫度。在第一次掃描測量結(jié)束后將樣品迅速冷卻至20℃，然后進(jìn)行再一次掃描，從圖1中可以看出重復(fù)掃描后并沒有出現(xiàn)吸熱或放熱峰，說明第一次加熱掃描后鮭魚膠原蛋白已經(jīng)發(fā)生了不可逆性熱變性［12］。

圖1 鮭魚膠原蛋白的DSC曲線Fig.1 The curve of salmon collagen on DSC

2.2 超聲波、微波對SSP超氧陰離子自由基清除能力的影響

由圖2可知:經(jīng)超聲波、微波處理后，SSP超氧陰離子自由基清除能力分別為57.64%和64.02%，明顯高于常規(guī)加熱處理的酶解液(54.4%)。說明在一定的條件下蛋白酶解液經(jīng)超聲波、微波處理后其超氧陰離子自由基清除能力均有一定程度的提高;這可能是由于微波加熱極性物質(zhì)，加速了分子之間的碰撞，使埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的基團(tuán)斷裂，降解成更小的肽段，使某些具有抗氧化性的氨基酸暴露使其超氧陰離子自由基清除能力增強(qiáng)［13］。這與崔蕊靜等［14］報(bào)道的經(jīng)微波輔助處理后的豆奶加酶水解效果顯著提高相一致;而超聲波具有空穴效應(yīng)和熱效應(yīng)使得蛋白質(zhì)一些活性基團(tuán)暴露［15］，從而使其超氧陰離子自由基清除能力增強(qiáng)［16］;由圖2知經(jīng)超聲波微波共同輔助處理后，SSP超氧陰離子自由基清除能力達(dá)到67.21%，說明在一定的條件下超聲波與微波在制備抗氧化肽過程中具有協(xié)同效應(yīng)。

2.3 超聲波、微波對SSP結(jié)構(gòu)的影響

為了探討超聲波、微波作用對超氧陰離子自由基清除能力影響的作用機(jī)理，對SSP的紫外吸收光譜及紅外吸收光譜進(jìn)行了研究。

2.3.1 SSP的紫外吸收光譜的研究 由圖3(a)及(c)可知經(jīng)微波及超聲波-微波共同處理后鮭魚肽的紫外吸收光譜為230.0nm，與對照組未經(jīng)超聲波、微波處理的SSP的最大吸收波長233.0nm相比均發(fā)生了藍(lán)移，這說明了經(jīng)微波及超聲波-微波協(xié)同作用后的SSP構(gòu)象發(fā)生了改變。而由圖3(b)可知經(jīng)超聲波處理后的SSP的紫外吸收與對照組幾乎完全重合。這可能是由于超聲波作用引起鮭魚肽構(gòu)象的改變是可逆的，是具有時(shí)效性的。

圖2 超聲波、微波對SSP超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.2 Effect of ultrasound and microwave in salmon peptides on the scavenging activity

圖3 SSP紫外吸收光譜圖Fig.3 UV-Vis spectra of SSP

2.3.2 SSP紅外吸收光譜的研究 在1700～1600cm-1區(qū)域內(nèi)的紅外光譜為蛋白質(zhì)的酰胺I帶，這與其特有的氫鍵形式密切相關(guān)，它反映了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲、轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)等信息。如圖4所示:與常規(guī)加熱酶解制備的SSP相比，經(jīng)超聲波、微波、及超聲波-微波共同處理后酶解制備的 SSP，在 1669cm-1處的 C=O伸縮峰，及1544cm-1處的N-H彎曲峰均發(fā)生偏移，且峰形變得更為尖銳，可以推測SSP的二級結(jié)構(gòu)經(jīng)過超聲波、微波處理后均發(fā)生了變化［7，17］。在 1450～ 1230cm-1附近有吸收峰表明了SSP三股螺旋結(jié)構(gòu)的完整性［18］。

圖4 SSP紅外吸收光譜圖Fig.4 IR spectrum of SSP

2.4 SSP氨基酸組成分析

2.4.1 SSP水解后色氨酸的測定 在發(fā)射光譜為(EM)=360nm，在激發(fā)光譜為210～420nm的范圍內(nèi)快速掃描，確定其激發(fā)波長，如圖5所示，其激發(fā)波長286.4nm。

在激發(fā)波長為286.4nm，發(fā)射波長為360nm下測定水解后SSP的熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)色氨酸的熒光強(qiáng)度曲線，計(jì)算樣品中色氨酸的質(zhì)量百分比為0.0938%。

圖5 不同濃度的色氨酸的熒光光譜圖EM=360nm(在尿素溶液中)Fig.5 Fluorescence spectra of the Trp at different consistence EM=360nm(in urea solution)

圖6 水解色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of hydrolyzed tryptophan

2.4.2 SSP水解后氨基酸分析 抗氧化性氨基酸具有延緩運(yùn)動性疲勞發(fā)生、快速消除運(yùn)動后疲勞、改善肝功能、防止皮膚老化等功效，具有較高的營養(yǎng)保健功能［21-22］。2003年 Saiga等［23］報(bào)道了經(jīng)不同的酶酶解的豬肌原纖維蛋白，其抗氧化性的差異與其水解后疏水性氨基酸Glu、Asp、Lys的組成有關(guān)。2007年Li B等［24］報(bào)道了Met、Tyr、Phe和H is四種與自由基清除效果有關(guān)的氨基酸。Met和Cys是含硫的氨基酸，其抗氧化保護(hù)作用可以通過其自身的抗氧化作用以及合成具有重要抗氧化作用的谷胱甘肽2種途徑實(shí)現(xiàn)［25］。蛋白質(zhì)及肽類物質(zhì)的氨基酸種類、數(shù)量及排列順序共同決定著其抗氧化性能。對SSP水解后游離氨基酸及經(jīng)過微波、超聲波處理后SSP游離氨基酸的測定結(jié)果如圖7、圖8和表1、表2。

圖7 SSP的氨基酸分析圖譜(吸收波長=570nm)Fig.7 Chromatogram showing the amino acid profiles in SSP(wavelength=570nm)

圖8 SSP的脯氨酸分析圖譜(吸收波長=440nm)Fig.8 Chromatogram showing the pro in SSP(wavelength=440nm)

由圖7、圖8及表1知，SSP氨基酸種類齊全，共有18種氨基酸(其中色氨酸通過熒光分光光度計(jì)測定)，含有8種必需氨基酸，且氨基酸總量較高，為51.10%，其中必需氨基酸的含量為11.21%，可以作為保健品開發(fā)利用。

由表1知，抗氧化性氨基酸總量為18.02%:谷氨酸含量最為豐富，為6.45%，其次是疏水性氨基酸Asp、Lys、Leu含量較多，分別為 3.96%、2.17%、1.48%，Met和Cys含硫的氨基酸總量2.84%。由表2知 SSP游離氨基酸量較小，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為9.48%，而其水解后氨基酸總量達(dá)到51.10%(表1)。經(jīng)過微波、超聲波、超聲波-微波共同處理后，SSP游離氨基酸中與抗氧化相關(guān)的氨基酸總量變化不顯著。證實(shí)了其活性物質(zhì)為小分子肽類物質(zhì)，同時(shí)結(jié)合圖2可以推測，SSP經(jīng)微波、超聲波及超聲波-微波共同處理后其抗氧化性質(zhì)的變化主要是影響了SSP肽的組成。

表1 SSP水解后氨基酸組成分析Table1 Composition and contents of amino acids in SSP

表2 不同處理的SSP游離氨基酸組成分析(%)Table2 Composition and contents of free amino acids in SSP through different treatment(%)

3 結(jié)論

在一定條件下鮭魚膠原蛋白酶解液經(jīng)超聲波、微波處理其超氧陰離子自由基清除能力均得到一定程度的提高。通過紫外與紅外等分析方法，發(fā)現(xiàn)經(jīng)微波、超聲波-微波共同處理后鮭魚肽的紫外吸收光譜均發(fā)了藍(lán)移，其紅外吸收光譜在1669cm-1處C=O伸縮峰，及1544cm-1處的N-H彎曲峰均發(fā)生偏移，且峰形變得更為尖銳，可以推測鮭魚肽的二級結(jié)構(gòu)經(jīng)過超聲波、微波處理后均發(fā)生了變化。通過進(jìn)一步分析鮭魚肽的氨基酸組成發(fā)現(xiàn):經(jīng)過微波、超聲波及超聲波-微波共同處理后，鮭魚肽游離氨基酸中與抗氧化相關(guān)的氨基酸總量變化不顯著，證實(shí)了其活性物質(zhì)為小分子肽類物質(zhì)。

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