脈沖強(qiáng)光對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜損傷及胞內(nèi)酶活性的影響

張佰清 郭佳佳

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

脈沖強(qiáng)光對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜損傷及胞內(nèi)酶活性的影響

張佰清 郭佳佳

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

通過(guò)脈沖強(qiáng)光處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大腸桿菌細(xì)胞懸液，研究菌體細(xì)胞膜通透性及胞內(nèi)酶活性的變化。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)的漏出量及丙二醛的生成量均隨大腸桿菌存活率的下降而增加，在處理電壓1 500V、閃照次數(shù)32次的條件下，蛋白質(zhì)漏出量為13.03μg/mL，丙二醛生成量為2.76nmol/L，對(duì)氯化鈉的耐受性明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）。此外，胞內(nèi)酶活性與處理前相比均有所降低，超氧化物歧化酶活性最低降至83.78%，過(guò)氧化氫酶活性最低降至76.92%。因此，細(xì)菌屏障結(jié)構(gòu)破壞所造成的細(xì)胞膜滲透壓及通透性改變，可使細(xì)菌胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生改變，甚至導(dǎo)致菌體死亡，羥自由基可能對(duì)致死細(xì)胞的協(xié)同作用有一定的意義。

脈沖強(qiáng)光；大腸桿菌；細(xì)胞膜損傷；胞內(nèi)酶活性

脈沖強(qiáng)光作為一種冷殺菌技術(shù)，是利用極強(qiáng)的直流電通過(guò)充有惰性氣體的燈管，發(fā)出比地面上太陽(yáng)光強(qiáng)近2萬(wàn)倍的光能，照射于食品表面，從而有效致死各種微生物［1］。該技術(shù)對(duì)食品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分影響很小，可有效的保持食品質(zhì)量，延長(zhǎng)貨架期。目前對(duì)其在微生物致死效果方面的研究較多，而對(duì)致死機(jī)理的報(bào)道較少。因此，選擇衛(wèi)生檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌大腸桿菌進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)研究細(xì)胞膜損傷及胞內(nèi)抗氧化酶活性的變化，分析脈沖強(qiáng)光對(duì)微生物細(xì)胞產(chǎn)生的不同生物效應(yīng)，從而為其致死機(jī)理提供理論依據(jù)［2］。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DNP－9082型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－6型，國(guó)華電器有限公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV－2000型，尤尼科（上海）儀器有限公司；

臺(tái)式高速離心機(jī)：TG16－WS型，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

脈沖強(qiáng)光冷殺菌裝置：波長(zhǎng)范圍為200～1100nm、光脈沖的脈沖寬度為20μs、最大輸入能量為644J，自行研制；

全溫振蕩培養(yǎng)箱：HZP－250型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電子天平：JY2002型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

手提式不銹鋼蒸氣消毒器：YX280A型，上海三申醫(yī)療器械有限公司；

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：Y92－Ⅱ型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

數(shù)字式酸度計(jì)：PHS－25型，上海日島科學(xué)儀器有限公司；

超凈工作臺(tái)：SZX－ZP型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試驗(yàn)材料及試劑

大腸桿菌（E.coli）菌種：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基；

鹽酸、氫氧化鈉、乙醇（95%）、結(jié)晶牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G－250、磷酸（85%）、三氯醋酸、硫代巴比妥酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三羥甲基氨基甲烷、丙三醇、二乙三氨五乙酸、鄰苯三酚、VC、30%H2O2等：分析純（AR），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脈沖強(qiáng)光處理 將搖瓶培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli懸液經(jīng)5 000r/min離心10min得菌體沉淀，重新懸浮于50mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.8）中，使菌懸液濃度約為109CFU/mL。在每個(gè)直徑為75mm的培養(yǎng)皿中加入6mL的菌懸液，放在殺菌處理室中央，按照試驗(yàn)設(shè)置進(jìn)行處理［3］。每個(gè)處理3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。處理電壓：800，1 000，1 500，2 000，2 500V；閃照次數(shù)：4，8，16，24，32。

1.3.2 漏出蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 取脈沖強(qiáng)光處理后的菌懸液，4℃下以12 000r/min的轉(zhuǎn)速離心8min，得到的上清液為粗酶液，蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法［4］。蛋白質(zhì)滲漏量按式（1）計(jì)算：

蛋白質(zhì)滲漏量＝試驗(yàn)組蛋白含量－對(duì)照組蛋白含量（1）

1.3.3 脈沖強(qiáng)光與NaCl的協(xié)同作用 將未經(jīng)處理的對(duì)照組及經(jīng)脈沖強(qiáng)光處理后的菌懸液，分別接種在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基及另加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、3%、5%、7%、9%NaCl的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。置37℃溫箱培養(yǎng)24h，用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，比較在不同NaCl含量培養(yǎng)基上的E.coli存活率。

1.3.4 殺菌效果與羥自由基（·OH）作用的觀察 用50mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.8）懸浮E.coli菌體，經(jīng)脈沖強(qiáng)光處理后以普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板涂布法活菌計(jì)數(shù)。另用1mol/L甘油懸浮菌體，脈沖強(qiáng)光處理后按前述方法活菌計(jì)數(shù)。殺菌率按式（2）計(jì)算：

1.3.5 細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的測(cè)定 參照陳勤的TBA法［5］并略加改進(jìn)。脈沖強(qiáng)光處理后的菌懸液冰浴下用超聲波破碎細(xì)胞（功率600W，連續(xù)破碎5s，間隔30s，破碎15次），再于4℃下6 000r/min離心20min取上清液用于丙二醛（MDA）含量的測(cè)定。

1.3.6 胞內(nèi)酶活性的測(cè)定 將破壁后的E.coli菌懸液于4℃下10 000r/min離心20min，上清液即為粗酶液。超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定采用改良的鄰苯三酚自氧化法，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定采用Beers＆Sizers法，并做相應(yīng)改進(jìn)［6］。相對(duì)酶活性按式（3）計(jì)算：

2 結(jié)果與分析

2.1 漏出蛋白質(zhì)含量的考察

蛋白質(zhì)廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中，對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝起著重要的作用。蛋白質(zhì)嚴(yán)重受損，會(huì)直接導(dǎo)致菌體死亡。由表1可知，在閃照6次的條件下，漏出蛋白含量與處理電壓呈正相關(guān)，當(dāng)處理電壓從1 000V到2 000V時(shí)，漏出蛋白含量明顯增加，當(dāng)處理電壓超過(guò)2 000V時(shí)，增加緩慢；在處理電壓為1 500V的條件下，漏出蛋白含量與閃照次數(shù)呈正相關(guān)，當(dāng)閃照次數(shù)從1次到8次時(shí)，漏出蛋白含量明顯增加，當(dāng)閃照次數(shù)大于8次時(shí)，增加緩慢，當(dāng)閃照次數(shù)為32次時(shí)，達(dá)到最高值13.03μg/mL。隨著脈沖強(qiáng)度的增加，漏出蛋白不斷增加，可能是脈沖強(qiáng)光作用于菌體胞壁或胞膜，使之通透性增加的結(jié)果。當(dāng)脈沖強(qiáng)度過(guò)大時(shí)，曲線較低強(qiáng)度處理趨于平緩，這可能是因?yàn)楦邚?qiáng)度脈沖處理存活下來(lái)的菌體本身較少，故被殺滅的也少，致使漏出蛋白質(zhì)含量的增加也減少。

表1 脈沖強(qiáng)光對(duì)E.coli漏出蛋白質(zhì)含量的影響Table 1 Effect of pulsed light irradiation on the leakage of protein content of E.coli

2.2 對(duì)NaCl耐受性考察

E.coli經(jīng)脈沖強(qiáng)光照射后，置NaCl溶液中，可加速其死亡。由圖1可知，經(jīng)1 200V、閃照5次脈沖強(qiáng)光處理后的菌懸液對(duì)NaCl的耐受性明顯低于未經(jīng)脈沖強(qiáng)光處理的對(duì)照組（P＜0.01），并且E.coli存活率隨著NaCl濃度的增高而顯著降低，當(dāng)NaCl濃度為3%時(shí)，存活率已下降為31.5%。這可能是因?yàn)槊}沖強(qiáng)光使菌體胞膜受到損傷，引起通透性增加，從而對(duì)潛在性抑制劑的敏感性增高，屏障作用有所降低，胞外高滲溶液更容易加速菌體的死亡。

2.3 ·OH生成量對(duì)殺菌效果的影響

由于菌體處于水環(huán)境中，故·OH是主要的自由基?！H是一種非?；钴S的自由基，可導(dǎo)致細(xì)胞膜成分的過(guò)氧化，從而引起細(xì)胞膜流動(dòng)性、通透性、不對(duì)稱性和完整性的破壞，致使細(xì)胞死亡。

由圖2、圖3可知，E.coli的存活率與脈沖強(qiáng)度的增加呈負(fù)相關(guān)。在閃照5次的條件下，存活率隨處理電壓的增大而降低，處理電壓為1 500V時(shí)，存活率僅為5.92%；在處理電壓為1 200V的條件下，存活率隨閃照次數(shù)的增大而降低，閃照8次，存活率已降低到8.62%。當(dāng)1mol/L甘油俘獲·OH后E.coli的存活率均有所增加，但差異不顯著（P＞0.05）。加入甘油后，E.coli存活率高于對(duì)照組，這是因?yàn)楦视头@·OH后使其不能攻擊菌體或攻擊作用減少，也就是說(shuō)菌體死亡一部分是·OH生成的結(jié)果。但這并不是脈沖強(qiáng)光致死微生物的主要原因。

圖1 脈沖強(qiáng)光作用后E.coli對(duì)NaCl的耐受性變化Figure 1 Effect in NaCl tolerance of E.coli after pulsed light irradiation

圖2 處理電壓對(duì)E.coli存活率的影響Figure 2 Effect of treatment voltage on the survival rate of E.coli

圖3 閃照次數(shù)對(duì)E.coli存活率的影響Figure 3 Effect of irradiation times on the survival rate of E.coli

2.4 脈沖強(qiáng)光作用與MDA生成量的關(guān)系

機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基能通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化物的分解產(chǎn)物改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性和滲透性，引起細(xì)胞損傷。因而MDA的含量常?？梢苑从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。

由表2可知，在閃照5次的條件下，MDA的生成量隨處理電壓的增大而增多；在處理電壓為1 500V的條件下，MDA的生成量隨閃照次數(shù)的增大而增多。測(cè)定結(jié)果表明，脈沖強(qiáng)光可使E.coli脂質(zhì)過(guò)氧化，MDA的生成量與E.coli存活率相關(guān)。

表2 脈沖強(qiáng)光作用后E.coli胞內(nèi)MDA生成量檢測(cè)Table 2 Change of MDA in E.coli after pulsed light irradiation

2.5 胞內(nèi)酶活性的變化

由于氧化應(yīng)激態(tài)會(huì)造成細(xì)胞的損傷，而抗氧化酶系則可清除自由基，預(yù)防氧化應(yīng)激態(tài)的發(fā)生。SOD、CAT是抗氧化酶系的兩種基礎(chǔ)代謝酶，通過(guò)檢測(cè)其活性變化來(lái)反映脈沖強(qiáng)光對(duì)E.coli處理后細(xì)胞損傷狀況。表3，表4分別顯示的是脈沖強(qiáng)光作用后E.coli胞內(nèi)SOD和CAT的活性變化。

表3 脈沖強(qiáng)光作用后E.coli胞內(nèi)SOD活性變化Table 3 Change of SOD activity in E.coli after pulsed light irradiation

表4 脈沖強(qiáng)光作用后E.coli胞內(nèi)CAT活性變化Table 4 Change of CAT activity in E.coli after pulsed light irradiation

由表3、表4可知，隨著脈沖強(qiáng)度的增大，SOD和CAT的活性都有所降低，但這種降低幅度不大。在處理電壓為1 200V的條件下，閃照32次時(shí)，SOD活性降低了14.49%；在處理電壓為2 000V的條件下，閃照40次時(shí)，CAT活性降低了23.08%。SOD和CAT是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶，它們的失活應(yīng)該不是細(xì)胞死亡直接引起的，因?yàn)榧?xì)胞死亡后細(xì)胞內(nèi)的酶應(yīng)該是逐漸失活的，而電壓800V、閃照4次的脈沖條件處理后就己經(jīng)能夠使細(xì)胞內(nèi)的酶活性有所降低了。

3 結(jié)論

隨著脈沖強(qiáng)度的增加，蛋白質(zhì)漏出量和MDA生成量均有所增加，在處理電壓為1 500V、閃照次數(shù)由4次增加至32次的條件下，蛋白質(zhì)漏出量由6.75μg/mL增加至13.03μg/mL，MDA生成量由1.46nmol/L增加至2.76nmol/L；對(duì)NaCl的耐受性明顯低于對(duì)照組，當(dāng)NaCl濃度為9%時(shí)，對(duì)照組的存活率為88.4%，而脈沖組的存活率僅為4.8%。菌懸液中·OH與未經(jīng)脈沖強(qiáng)光處理的相比較有所增加，胞內(nèi)抗氧化酶活性降低，SOD活性最低降至83.78%，CAT活性最低降至76.92%。以上數(shù)據(jù)表明，脈沖強(qiáng)光處理對(duì)E.coli的細(xì)胞膜造成了嚴(yán)重?fù)p傷，并大幅降低了胞內(nèi)酶的活性，這也可能是E.coli致死的主要原因之一。

1 周萬(wàn)龍，高大維.脈沖強(qiáng)光殺菌技術(shù)的研究［J］.食品科學(xué)，1998（1）：16～19.

2 Dunn J，Ott T，Clark W.Pulsed－light treatment of food and packaging［J］.Food Technology，1995（9）：95～98.

3 錢存柔.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京：北京大學(xué)出版社，1985：176.

4 陳雅蕙，袁明秀.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法［M］.北京：北京大學(xué)出版社，2006：240～242.

5 陳勤.抗衰老的研究方法［M］.北京：中國(guó)醫(yī)學(xué)科技出版社，1996：485～490.

6 施特爾馬赫.酶的測(cè)定方法［M］.錢嘉淵，譯.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1992：186～188.

Damage ofE.colicell membrane and intracellular enzymic activity induced by pulsed light irradiation

ZHANG Bai－qingGUO Jia－jia

（Food Science College of Shenyang Agricultural University，Shenyang，Liaoning110161，China）

After pulsed light treatment on the suspension ofE.coliin logarithmic growth phase，research the change of cell membrane permeability and intracellular enzymic activity.The result indicated that protein leakage and MDA formation increased with the decline of the survival rate ofE.coli.Through pilot studies，drawn input voltage to 1 500V，flash as 32times，the leakage of protein was 13.03μg/mL and the formation amount of MDA was 2.76nmol/L.NaCl tolerance was obviously lower than the control group（P＜0.01）.In addition，intracellular enzymic activity lower than untreated，SOD was decreased to 83.78%as well as CAT was decreased to 76.92%.Therefore，the damage of cell barrier structure caused the change of osmotic pressure and cell membranes permeability.It can change intracellular bacterial substances even it caused cell died.It would be certain meaning that synergistic reaction which hydroxyl radicals acted on lethality cell.

pulsed light；E.coli；membrane damage；intracellular enzymic activity

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.017

張佰清（1966－），男，沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)副教授。E－mail：sybaiqingxl＠sina.com

2010－06－11