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    纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選和鑒定

    2010-12-27 08:50:54魏亞琴邵建寧麻和平張文齊
    食品與機械 2010年5期
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)酶羧甲基初篩

    魏亞琴邵建寧麻和平張文齊

    楊 勇3劉彩云1趙昊星1慕婷婷1

    (1.甘肅省科學(xué)院,甘肅 蘭州 730000;2.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅 蘭州 730000;3.南開大學(xué)生命科學(xué)院,天津 300071)

    纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選和鑒定

    魏亞琴1,2邵建寧1麻和平1張文齊1

    楊 勇3劉彩云1趙昊星1慕婷婷1

    (1.甘肅省科學(xué)院,甘肅 蘭州 730000;2.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅 蘭州 730000;3.南開大學(xué)生命科學(xué)院,天津 300071)

    從蘭州榆中縣興隆山國家自然保護區(qū)采集土樣,先用羧甲基纖維素鈉剛果紅培養(yǎng)基篩選出79株Hc值較大的產(chǎn)纖維素酶菌株,再經(jīng)液體發(fā)酵復(fù)篩測CMC酶活和濾紙酶活。結(jié)果表明,經(jīng)復(fù)篩后菌株No-15A的纖維素酶活力最高,羧甲基纖維素酶活1 376.20U/mL,濾紙酶活497.78U/mL,其粗酶液分解濾紙快速明顯,且該菌株生長速度最快,每日菌落直徑增長量為4~5cm。經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定菌株No-15A屬青霉。

    纖維素酶;羧甲基纖維素酶活;濾紙酶活;青霉

    纖維素是自然界分布最廣泛、最豐富、最廉價的多糖物質(zhì),是植物細胞壁主要成分[1],也是地球上年產(chǎn)量最大,具有巨大潛力的可再生天然資源。據(jù)估計,纖維素生成量每年高達1 000多億t,中國每年農(nóng)作物秸稈總產(chǎn)量為7億多t,僅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中形成的農(nóng)作物殘渣,如稻草、玉米秸、麥秸,每年就5億t之多[2],目前這些資源大部分通過簡單焚燒,在浪費能源的同時也對環(huán)境造成污染。隨著石油、煤炭、天然氣等不可再生資源日漸耗竭,有效轉(zhuǎn)化,科學(xué)利用數(shù)量極其龐大的纖維素資源具有廣闊的前景[3]。利用纖維素酶水解纖維素成葡萄糖并進一步發(fā)酵轉(zhuǎn)化成燃料乙醇、SCP飼料蛋白和各種平臺化合物等,對緩解全球能源危機、飼料資源和化工原料緊張,保護環(huán)境等均具有重大意義[4]。

    纖維素酶是一組降解纖維素生成葡萄糖的復(fù)雜酶系,完整的纖維素酶系由3類酶組成:內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶,它作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū),隨機水解1,4-糖苷鍵,產(chǎn)生大量有非還原端的小分子纖維素;外切β-1,4-葡聚糖酶,它主要作用于纖維素線狀分子末端,水解β-1,4-糖苷鍵,每次切下一個纖維二糖分子;β-葡萄糖苷酶,它的作用是水解纖維二糖及低分子量的纖維寡糖生成葡萄糖[5]。3種酶必須比例合理,才能很好地發(fā)揮協(xié)同降解纖維素的作用。

    從自然界篩選纖維素酶高產(chǎn)菌是構(gòu)建高效纖維素分解技術(shù)的基礎(chǔ)性工作[6]。甘肅省蘭州榆中縣境內(nèi)的興隆山森林覆蓋率高、雨水充沛、氣候溫涼濕潤,形成了極其豐富的微生物資源。本試驗擬從興隆山森林土壤中分離篩選出產(chǎn)纖維素酶活較高的菌株,以便進一步研究開發(fā)利用。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與儀器

    羧甲基纖維素鈉:天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;

    吐溫-80:天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;

    新華1號濾紙:蘭州化學(xué)物理研究所;

    硝基水楊酸試劑:天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;

    分光光度計:721型,武漢邁新醫(yī)療設(shè)備有限公司;

    光學(xué)顯微鏡:AQ-2010C,上海光學(xué)儀器廠。

    1.2 培養(yǎng)基

    1.2.1 羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基 羧甲基纖維素鈉5g,K2HPO41g,NaNO33g,KCL 0.5g,MgSO40.5g,F(xiàn)eSO40.01g,瓊脂17g,蒸餾水1 000mL。pH值5.5~6.0。

    1.2.2 斜面活化保藏培養(yǎng)基 去皮馬鈴薯200g,麥芽糖20g,瓊脂15g,蒸餾水1 000mL。pH自然。

    1.2.3 液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基 微晶纖維素粉10g,麩皮10g,(NH4)2SO43g,MgSO40.4g,CaCl2 0.4g,KH2PO41g,吐溫-801mL,酵母膏 0.5g,蛋白胨 2g,蒸餾水1000mL。pH自然。培養(yǎng)基均在0.11MPa,121 ℃,滅菌30min備用。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品采集 在興隆山次生林區(qū)采集距表層5cm處的潮濕腐質(zhì)土壤、枯葉、腐爛朽木等。

    1.3.2 菌株的初篩 稱取樣品適量,剪碎研磨后加入100mL滅菌生理鹽水,并帶玻璃珠的三角瓶中充分振搖均勻,稍靜置后取上清液用無菌生理水稀釋后涂布到初篩培養(yǎng)基表面,即羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)4~5d后,往長菌平板中加入適量1mg/mL剛果紅溶液,染色1h,棄去染液后,加入適量1mol/L的NaCl溶液洗滌,挑選產(chǎn)水解圈直徑與菌落直徑比值Hc較大的菌落于初篩培養(yǎng)基劃線分離純化后接入斜面活化保藏培養(yǎng)基。

    1.3.3 菌株的復(fù)篩 將初篩獲得的菌株制備濃度為107個/mL的孢子懸液,取4mL接種于內(nèi)裝40mL液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基[7]的容積為250mL的三角瓶中。旋轉(zhuǎn)式搖床220r/min培養(yǎng),發(fā)酵48h前30℃,48h后28℃,發(fā)酵第6天檢測酶活,篩選出CMC酶活和濾紙酶活均較高的菌株。

    1.3.4 酶活測定 采用DNS法測定CMC酶活和濾紙酶活[8]。CMC酶活和濾紙酶活單位定義是:以CMCNa或新華濾紙為底物,在pH 4.8,50℃,1mL酶液1min水解底物生成1μg葡萄糖為1個酶活單位,以U表示。

    1.3.5 纖維素酶高產(chǎn)菌生長速度及形態(tài)學(xué)鑒定 初篩和復(fù)篩篩選出CMC酶活和濾紙酶活同時較高的菌株。將其接種到馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基,28~30℃培養(yǎng),連續(xù)觀察平板上菌株從開始生長到產(chǎn)大量孢子過程中菌落生長狀況,測量菌落每日直徑增長量,計算菌落生長速度。觀察菌落顏色、大小、邊緣和表面質(zhì)地、紋飾、滲出物、氣味及菌落在平板正反面顏色,培養(yǎng)基顏色,菌絲長勢、生長密度,產(chǎn)孢時間、孢子顏色及每日產(chǎn)孢量變化等。

    絲狀真菌制片[9]:載片中央滴加一小滴乳酸石炭酸溶液,然后用接種針從菌落邊緣挑取少許菌絲體和孢子置于其中攤開,低倍鏡和高倍鏡下觀察菌絲、分生孢子梗、分生孢子鏈、分生孢子等形態(tài)。

    形態(tài)學(xué)鑒定:觀察菌落形態(tài),鏡檢菌絲及分生孢子梗、孢子鏈、孢子形態(tài),并結(jié)合《真菌鑒定手冊》[10],將菌株相應(yīng)特征與檢索表中對比,進行被選菌株形態(tài)學(xué)的初步分類。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株的初篩

    土樣稀釋液涂布于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板表面,培養(yǎng)至第6天用剛果紅染色法觀察水解圈,有200多個菌落周圍產(chǎn)生了清晰水解圈,有真菌、細菌、放線菌。菌落有透明、粉紅、乳白、墨綠、青綠、灰綠、黃綠、黃褐、桔黃、灰白、黑色等。從中挑選了水解圈與菌落直徑比值Hc較大的纖維素酶產(chǎn)生菌確定為初選菌株。形態(tài)觀察初選菌株以真菌為主,還有較多細菌和個別放線菌,真菌中以霉菌為主。見圖1。

    圖1 菌株No-15A在羧甲基纖維素鈉平板上產(chǎn)生的水解圈Figure 1 Transparent circle on CMCNa culture medium of the strain No-15A

    2.2 菌株的復(fù)篩

    初選菌株發(fā)酵產(chǎn)酶后,測其粗酶液的酶活,測3次取平均值。以酶活值為復(fù)篩標(biāo)準(zhǔn)篩選出CMC酶活和濾紙酶活同時較高的15株,且其形態(tài)以霉菌為主。由表1可知,No-15A的菌株酶活最高,其 CMC酶活1 376.2U/mL,F(xiàn)PA酶活497.78U/mL。由圖2可知,菌株 No-15A 的稀釋粗酶液0.5mL與50mg濾紙條于pH 4.8,反應(yīng)1h后,稀釋粗酶液對濾紙條分解效果明顯。

    2.3 纖維素酶高產(chǎn)菌生長速度及形態(tài)學(xué)鑒定

    將菌株No-15A接種于PDA培養(yǎng)基,恒溫箱28℃培養(yǎng),生長十分迅速,接種培養(yǎng)基第1天開始長出菌落,并在培養(yǎng)基上迅速擴散;第2天菌落直徑達5~6cm,菌絲濃密粗壯,交聯(lián)狀態(tài)好,有橫隔,且極易產(chǎn)生分生孢子;第3天菌落直徑達9~10cm,菌落長滿覆蓋整個培養(yǎng)皿,且產(chǎn)孢量多。菌株生長速度是:每日直徑增長量為(4±0.5)cm。將菌株No-15A接種在PDA,恒溫箱30℃培養(yǎng),菌落長勢依然旺盛,菌落每日直徑增長略大(4±0.5)cm,生長速度稍快。經(jīng)與其它14株菌生長形態(tài)及菌落直徑大小做對比可知:菌株No-15A的生長速度最快。

    表1 纖維素酶產(chǎn)生菌酶活Table 1 Enzyme activity of the cellulase-producing strains

    圖2 菌株No-15A粗酶液分解濾紙條Figure 2 Decomposition for filter paper strip of the strain No-15A’s cellulase

    菌株No-15A在PDA培養(yǎng)基上菌落呈氈狀,質(zhì)地致密厚實,與培養(yǎng)基連接緊密;菌落有特殊香味;菌落轉(zhuǎn)色快,正面淡灰綠色,外圍有較窄白色菌絲圈帶;菌落背面淡茶褐色至黃褐色;并隨培養(yǎng)時間逐漸加深;菌絲有橫隔膜,細胞中有細胞核;分生孢子梗從菌絲垂直生出集成束狀,其頂端有一至多次分枝呈掃帚狀,掃帚枝最后一級分枝是產(chǎn)生分生孢子的小梗,每一小梗頂端著生成串分生孢子,分生孢子串呈不分枝鏈狀;孢子橢圓形,光滑,呈青綠色。據(jù)菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果初步鑒定菌株No-15A是真菌門,半知菌亞門,絲孢綱,從梗孢目,叢梗孢科,從梗孢科單胞亞科,曲霉族,青霉屬(Penicillium)。見圖3和圖4。

    圖3 菌株No-15A的菌落形態(tài)Figure 3 Colony morphology of the strain No-15A

    圖4 鏡檢菌株No-15A的菌絲和分生孢子形態(tài)Figure 4 Mycelium and conidiospore morphology of the strain No-15Aby microscope

    3 結(jié)論

    (1)采用羧甲基纖維素鈉剛果紅方法篩選纖維素酶產(chǎn)生菌,雖然較繁瑣,但它是一種有效的篩選方法。

    (2)興隆山森林土壤中蘊含著多種可有效分解纖維素的微生物,其中真菌占大多數(shù)。

    (3)篩選得到的纖維素酶高產(chǎn)菌株No-15A,經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為青霉屬,其酶活最高,生長十分迅速,值得進一步研究。今后將繼續(xù)通過理化誘變或發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化進一步提高菌株No-15A的CMC酶活和濾紙酶活,為工業(yè)應(yīng)用提供纖維素酶高產(chǎn)菌優(yōu)質(zhì)菌株。

    1 封曄,來航線,鄭真.高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2007,35(10):133~138.

    2 侯進慧,劉全德,高明俠.胡蘿卜表面產(chǎn)纖維素酶細菌初步鑒定分析[J].食品科學(xué),2010,31(5):233~236.

    3 朱濤.一株絲狀真菌胞外中性纖維素酶系的分離純化與酶功能的研究[D].濟南:山東大學(xué),2008.

    4 肖舸,雷芳,喻東,等.一株產(chǎn)纖維素酶綠色木霉的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].四川大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2004,41(2):422~425.

    5 Qin Zhang,Chi-Ming Lo,Lu-Kwang Ju.Factors affecting foaming behavior in cellulose fermentation byTrichoderma reeseiRutC-30[J].Bioresourcetechnology,2007,98(4):753~760.

    6 Zhou XG,Smith Joseph A,Oi Faith M,et al.Correlation of cellulose gene expression and cellulolytic activity throughout the gut of the termite reticulitermes flavipes[J].Gene,2007,395(12):29~39.

    7 陳文祥.產(chǎn)纖維素酶放線菌的篩選及其產(chǎn)酶條件與酶學(xué)性質(zhì)初探[D].成都:四川師范大學(xué),2007.

    8 李忠玲.產(chǎn)堿性纖維素酶放線菌的篩選及其產(chǎn)酶條件與酶學(xué)性質(zhì)初步研究[D].西安:西北大學(xué),2008.

    9 錢存柔,黃儀秀.微生物學(xué)實驗教程[M].北京:北京大學(xué)出版社,1999.

    10 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海:科學(xué)技術(shù)出版社,1979.

    Screening and identification of a high-yield cellulase strain

    WEI Ya-qin1,2SHAO Jian-ning1MA He-ping1ZHANGWen-qi1

    YANG Yong3LIU Cai-yun1ZHAO Hao-xing1MU Ting-ting1

    (1.Gansu Science Acdemics,Lanzhou,Gansu730000,China;2.Life school of lanzhou university,Lanzhou,Gansu730000,China;3.College of Life Sciences,Nankai University,Tianjin300071,China)

    The Xinglong Mountain in Yuzhong county of Lanzhou is a national nature reserve.Soil samples were collected from the forest area at the Xinglong Mountain.These samples were firstly screened by CMCNa Congo Red culture medium,and 79cellulase-producing strains were selected with larger Hc value.And then,these cellulase-producing strains were fermented and CMCase activity and FPA were measured.The experiment results show the activity of the strain No-15Awas highest.Its FPA activity was 497.78U/mL,and CMCase activity was 1376.20U/mL.The enzyme solution of the strain No-15Amade filter paper rotten very fast,and it’s colony growed more quickly than the other 14strains,the colony diameter increased a day is 4~5cm.according to the morphology characteristics,the strain No-15AisPenicillium.

    cellulase;CMCase activity;FPA;Penicillium

    10.3969 /j.issn.1003-5788.2010.05.006

    甘肅省科技計劃資助(編號:1010RJZA169)

    魏亞琴(1974-),女,甘肅省科學(xué)院工程師,碩士。E-mail:weiyq04@lzu.cn

    2010-05-20

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