趙州雪花梨多酚氧化酶酶學(xué)特性研究

楊光宇牟德華趙廣西葛 娜萬(wàn) 青

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.秦皇島市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，河北 秦皇島 066000；3.秦皇島市出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，河北 秦皇島 066004）

趙州雪花梨多酚氧化酶酶學(xué)特性研究

楊光宇1牟德華1趙廣西2葛 娜3萬(wàn) 青1

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.秦皇島市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，河北 秦皇島 066000；3.秦皇島市出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，河北 秦皇島 066004）

研究趙州雪花梨多酚氧化酶的酶學(xué)特性。結(jié)果表明：以鄰苯二酚為底物，雪花梨中多酚氧化酶的最適pH值為7.0，最適溫度為25℃；底物濃度與酶活成正相關(guān)，90℃處理4min可鈍化其活性；酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究表明，以鄰苯二酚為底物時(shí)，Vmax＝437U/min，Km＝0.015 6mM。

趙州雪花梨；多酚氧化酶；酶學(xué)特性

趙州雪花梨是河北省土特名產(chǎn)之一，至今已有2 000多年的栽培歷史，主要分布在河北省中南部，趙縣是著名的集中產(chǎn)區(qū)，故稱“趙州雪花梨”。目前，趙州雪花梨主要用于鮮食，深加工產(chǎn)品有雪花梨罐頭、梨脯、梨汁、梨酒等［1－2］。然而梨汁加工和貯藏過(guò)程中存在著嚴(yán)重的褐變現(xiàn)象，影響了產(chǎn)品的品質(zhì)，降低了產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力［3］。

果蔬汁加工過(guò)程中的褐變主要是酶促褐變，以多酚氧化酶引起的酶促褐變最為明顯。酶促褐變是多酚氧化酶催化果蔬中游離酚酸的羥基化反應(yīng)以及羥基酚到醌的脫氫反應(yīng)，醌在果蔬體內(nèi)自身縮合或與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)反應(yīng)，產(chǎn)生褐色色素或黑色素，從而發(fā)生褐變［4］。

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，簡(jiǎn)稱PPO）存在于許多果實(shí)中，是引起酶促褐變的主要酶類。水果種類不同，PPO的含量及其性質(zhì)也大不相同。本試驗(yàn)以趙州雪花梨為原料，研究了趙州雪花梨中PPO的酶學(xué)特性，為趙州雪花梨在深加工中防止褐變提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雪花梨：趙州雪花梨，從趙縣梨園采摘后存放于冷庫(kù)備用；

丙酮、鄰苯二酚、抗壞血酸、異抗壞血酸、檸檬酸、草酸、三氯乙酸：均為市售分析純。

1.2 設(shè)備

紫外分光光度計(jì)：SP－756P，上海光譜儀器有限公司；

醫(yī)用離心機(jī)：LG10－2.4A，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；

九陽(yáng)料理機(jī)：JYL－350，山東九陽(yáng)小家電有限公司；

恒溫水浴鍋：DF－101S，鞏義市英裕予華儀器廠；

電子分析天平：JJ100，美國(guó)雙杰兄弟（集團(tuán)）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 PPO粗酶的提取 取雪花梨200g，切成小塊，加入50mL冷丙酮（－22℃）混合打漿，加入100mL冷丙酮，充分?jǐn)嚢韬筮M(jìn)行抽濾，將濾渣溶于100mL冷丙酮中，反復(fù)抽濾至濾渣為無(wú)色。濾渣在室溫下干燥至恒重，加入100mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）4℃攪拌30min，經(jīng)兩層紗布過(guò)濾后，濾液在8 000r/m離心20min，取上清液為粗酶液，冷藏備用。

1.3.2 PPO活性的測(cè)定 以鄰苯二酚為底物，加入緩沖液和酶液后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)反應(yīng)液在420nm處的吸光度值（A值），每隔5s讀取一次A值。依據(jù)曲線最初的直線部分計(jì)算酶活力。以在1min內(nèi)引起吸光度變化0.001為一個(gè)酶活力單位（U）［5］。

1.3.3 PPO反應(yīng)時(shí)間的確定 以鄰苯二酚為底物，在25℃、pH 6.8的環(huán)境下加入粗酶液，反應(yīng)進(jìn)行1～10min，檢測(cè)PPO活性的變化，確定適宜反應(yīng)時(shí)間。

1.3.4 pH對(duì)PPO活性的影響 反應(yīng)液中加入不同pH的緩沖液進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定不同pH時(shí)的酶活。pH范圍取3～8，溫度25℃。反應(yīng)液總體積10mL，其組成：粗酶液0.1mL，鄰苯二酚溶液2mL（0.2M），緩沖液7.9mL。

1.3.5 溫度對(duì)PPO活性的影響 用恒溫水浴鍋調(diào)整不同的溫度，使整個(gè)酶反應(yīng)的體系處于不同的溫度中反應(yīng)一定時(shí)間，然后加入20%三氯乙酸終止反應(yīng)，檢測(cè)酶活。溫度范圍取20～70℃，反應(yīng)液總體積10mL，其組成：粗酶液0.1mL，鄰苯二酚溶液2mL（0.2M），緩沖液7.9mL。

1.3.6 PPO熱穩(wěn)定性的研究 用恒溫水浴鍋進(jìn)行加熱，每隔2min檢測(cè)一次酶活。溫度選取50，60，70，80，90℃，反應(yīng)液總體積10mL（粗酶液0.1mL，底物0.2M鄰苯二酚溶液2mL，緩沖液7.9mL）。

1.3.7 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究 在25℃、pH 6.8條件下檢測(cè)底物添加量不同時(shí)的酶的活性，做出底物濃度－酶活的曲線，并用雙倒數(shù)作圖法做LB曲線求出Vmax和Km值，做出米氏方程。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶反應(yīng)時(shí)間的確定

由圖1可知，趙州雪花梨中的PPO在以鄰苯二酚為底物，進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)速度在180s內(nèi)幾乎是呈直線上升，隨后反應(yīng)速度變慢，為了正確測(cè)定酶促反應(yīng)的速度，盡量避免各種因素干擾，本試驗(yàn)確定測(cè)定酶活的反應(yīng)時(shí)間為180s。

圖1 酶活與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系Figure 1 The relationship of PPO activity with reaction time

檢測(cè)時(shí)，比色皿中加入反應(yīng)液以后放入紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行時(shí)間掃描，而反應(yīng)液在比色皿中反應(yīng)時(shí)，由于接觸氧氣以及溶液中各組分分布的原因，反應(yīng)速度也不均勻，造成一部分反應(yīng)快，一部分反應(yīng)慢，反應(yīng)完以后還有一個(gè)色素均勻分布的過(guò)程，造成200s以后A值的下降。

2.2 pH對(duì)PPO活性的影響

PPO是一類蛋白質(zhì)，pH值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)蛋白構(gòu)象產(chǎn)生影響，影響PPO的活性。由圖2可知，雪花梨PPO的最適pH值在7.0左右，但是在5.0左右還有一個(gè)峰，原因是提取的粗酶液中可能存在著PPO的同工酶。這種現(xiàn)象在很多文獻(xiàn)中都有報(bào)道：宗亦臣等［6］在棗的PPO的研究中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象；Rocha等［5］在紅喬納金蘋果的PPO研究中同樣也發(fā)現(xiàn)了在5.0和7.5出現(xiàn)雙峰的現(xiàn)象；Estrella Nu′1ez－Delicado等［7］在拿破侖葡萄PPO研究中發(fā)現(xiàn)雙峰出現(xiàn)在4.0和6.0。所以，雙峰的出現(xiàn)不僅和PPO同工酶有關(guān)，峰出現(xiàn)的位置還與水果的品種有關(guān)。

2.3 溫度對(duì)PPO活性的影響

溫度是影響酶活性的重要因素，研究酶的最適溫度，在工業(yè)生產(chǎn)中有重要的意義。連毅等［8］研究了大蒜PPO的最適溫度為40℃；徐芹等［9］研究碭山酥梨PPO最適溫度為34℃；張福平等［10］研究佛手瓜PPO最適溫度為30℃。此外還有許多文獻(xiàn)研究了各種果蔬中的PPO的最適溫度，大部分都在30～50℃之間。由圖3可知，雪花梨PPO最適溫度為30℃，隨著溫度的升高，PPO的活性明顯下降，20～30℃酶活最高，酶的活性為381U。說(shuō)明大部分果蔬中的PPO的最適溫度相差不大。因此，酶的活性可能和果蔬的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。

圖3 溫度對(duì)趙州雪梨PPO活性的影響Figure 3 Effect of temperature on the activity of PPO in Zhaozhou snow pear

2.4 PPO的熱穩(wěn)定性

研究PPO的熱穩(wěn)定性有助于確定工業(yè)化生產(chǎn)中果蔬熱處理溫度，盡量在最短的時(shí)間內(nèi)最大限度地鈍化酶的活性，盡可能對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生最小的影響。

在50～70℃的溫度下，處理10min后，雪花梨PPO還能保留50%的活性，80℃處理10min后能保留30%的活性，90℃處理4min就能滅掉90%的酶活，但是再繼續(xù)加熱處理，酶活保留率變化很?。▓D4），所以90℃處理4min是最佳的滅酶條件。許多文獻(xiàn)也都報(bào)道了其他果蔬中PPO的熱穩(wěn)定性：枇杷PPO在85℃處理2.5min，酶活保留率僅為5%［11］；桑 果 PPO 在80 ℃ 處 理10min，酶 活 保 留 率 為10%［12］。和其它果蔬中PPO相比，雪花梨PPO的熱穩(wěn)定性更強(qiáng)，因此，在加熱滅酶這一環(huán)節(jié)，在雪花梨加工過(guò)程中需要更高的熱處理溫度或更長(zhǎng)的處理時(shí)間。

圖4 趙州雪梨PPO的熱穩(wěn)定性Figure 4 Thermal stability of PPO in Zhaozhou snow pear

2.5 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究

對(duì)底物濃度與雪花梨PPO活性關(guān)系的研究結(jié)果表明該酶催化反應(yīng)復(fù)合米氏方程曲線，可以由米氏方程表示。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用雙倒數(shù)作圖法作出Lineweaver－Burk曲線，如圖5所示。

圖5 雪花梨PPO酶促反應(yīng)的雙倒數(shù)曲線Figure 5 Lineweaver－Burk plot of PPO in Zhaozhou snow pear

由圖5可以求出Vmax＝ 437U/min，Km＝0.015 6mM，進(jìn)而得出酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的米氏方程（1）。

從Km值可以看出來(lái)酶對(duì)底物的親和性，Km值越小對(duì)底物的親和力越強(qiáng)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究表明，趙州雪花梨PPO最適pH 7.0，最適溫度30℃，在90℃條件下處理4min可有效鈍化PPO活性。在加工過(guò)程中控制pH和溫度可以有效的防止褐變的發(fā)生。酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)中，在以鄰苯二酚為底物時(shí)，Vmax＝437 U/min，米氏常數(shù)Km＝0.0156mM。

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7 Estrella Nu′1ez－Delicado，Marta Serrano－Megē′as，Antonio Jose′Pe′rez－Lo′pez，et al.Characterization of polyphenol oxidase from Napoleon grape［J］.Food Chemistry，2007（100）：108～114.

8 連毅，喬旭光，李燕，等.大蒜多酚氧化酶特性的研究［J］.食品科學(xué)，2007，28（11）：290～293.

9 徐芹，喬勇進(jìn)，方強(qiáng)，等.碭山酥梨多酚氧化酶酶學(xué)特性及抑制效應(yīng)的研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（4）：74～77.

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11 Chang－Kui Ding，Yoshinori Ueda，Yoshihiro Imahori.Purification and Properties of Polyphenol Oxidase from Loquat Fruit［J］.J.Agric.Food Chem，1998，46（10）：4 144～4 149.

12 Oktay Arslan，Mahmut Erzengin，Selma Sinan，et al.Purification of mulberry（Morus alba L.）polyphenol oxidase by affinity chromatography and investigation of its kinetic and electrophoretic properties［J］.Food Chemistry，2004（88）：479～484.

Enzymatic characteristics of polyphenol oxidase in Zhaozhou snow pear

YANG Guang－yu1MOU De－h(huán)ua1ZHAO Guang－xi2GE Na3WAN Qing1

（1.Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang，Hebei050018，China；2.Qinhuangdao City Institute of Products Quality Supervision and Inspection，Qinhuangdao，Hebei066000，China；3.Qinhuangdao Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qinhuangdao，Hebei066004，China）

Zhaozhou snow pear as the material，enzymatic characteristics of polyphenol oxidase（PPO）was studied in this paper.The results showed that the optimum pH for the pear PPO was 7.0and the optimum temperature was 25 ℃ with catechol as substrate.There was a positive correlation between the consistency of substrate and the enzyme activity，which would be inactivated after treated in 90℃for 4min.The research of enzymatic reaction kinetics showed the best activity toward catechol wasVmax＝ 437U/min，Km＝0.015 6mM.

Zhaozhou snow pear；polyphenol oxidase；enzymatic characteristics

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.003

楊光宇（1984－），男，河北科技大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：yangguangyu1984＠vip.qq.com

牟德華

2010－06－10