黔東南甜藤植物水溶性總黃酮提取及含量動(dòng)態(tài)研究

楊秀全　王紹云　周江菊

[摘 要]研究黔東南甜藤水溶性總黃酮最佳提取工藝、含量測(cè)定及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為其作為保健食材資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。以水為溶劑，在一定水浴溫度下，超聲提取甜藤中總黃酮，用分光光度法測(cè)定水溶性總黃酮的含量。通過單因素試驗(yàn)，再正交試驗(yàn)優(yōu)化甜藤中水溶性黃酮最佳提取條件。甜藤中水溶性總黃酮的最佳提取工藝條件為：液料比為25 ： 1，浸泡時(shí)間為110 min，超聲時(shí)間為60 min，水浴溫度為45 ℃，此條件下甜藤水溶性總黃酮得率為0.71%。黔東南不同地方的甜藤中水溶性總黃酮含量有較大的差別，以日照較長(zhǎng)的南部榕江縣的含量最高。不同季節(jié)甜藤莖中水溶性總黃酮的含量不同，12月采集的甜藤莖總黃酮含量最高。甜藤不同器官中黃酮類化合物的積累也不同，葉>果>莖。

[關(guān)鍵詞]黔東南；甜藤；總黃酮；含量測(cè)定；采收期

[中圖分類號(hào)]Q946 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

甜藤Paederia Scandens （Lour） Meer為茜草科雞屎藤屬草本植物，別名甜藤（貴州黔東南）、雞屎藤、牛皮凍、狗屁藤，香藤，國內(nèi)外均有分布，在我國主要分布于長(zhǎng)江流域及其南部地區(qū)，是傳統(tǒng)的中藥材。臨床上主要用于治療風(fēng)濕疼痛、胃腸疾病、骯腹疼痛、腎病、降脂降血糖、白血病及其他疑難雜癥，近年研究發(fā)現(xiàn)甜藤水提取液具有較強(qiáng)的抑菌作用，用于治療消化系統(tǒng)疾病療效獨(dú)特。甜藤的主要有效成分有環(huán)烯醚萜類、黃酮類、糖、多糖、氨基酸、抗壞血酸及其甙類、揮發(fā)油等多種天然產(chǎn)物，具有抗氧化、抗菌、消炎、抗腫瘤、保腎、鎮(zhèn)痛、降脂、降尿酸等藥理作用。甜藤不僅藥用，還是許多地區(qū)傳統(tǒng)特色美食的料理材料，貴州黔東南的 “甜藤粑”“侗果”，廣東的“雞藤煲老鴨”，海南的“雞屎香粑”等特色美食。貴州黔東南傳統(tǒng)特色食品甜藤粑和侗果制作的主要原料之一是甜藤莖的水提取液。

而大量文獻(xiàn)證實(shí)植物黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，具有抗氧化作用，抗菌、消炎、抗癌、調(diào)整免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌等多種醫(yī)療保健功能，已經(jīng)應(yīng)用到保健品、藥品、食品和化妝品等領(lǐng)域。

對(duì)于甜藤的研究主要集中在化學(xué)成分和臨床應(yīng)用，而有關(guān)甜藤植物中黃酮類化合物的研究鮮見報(bào)道。黔東南產(chǎn)甜藤中黃酮類化合物的研究尚未見報(bào)道。通過參考相關(guān)文獻(xiàn)，探究黔東南甜藤水溶性黃酮類化合物最佳提取工藝、含量測(cè)定及動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，為進(jìn)一步深層次發(fā)掘黔東南甜藤植物在保健食材資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：甜藤（莖、葉及果）樣品，2016年1月——2016年12月采于黔東南地區(qū)。將其洗凈，瀝干水分，置于50 ℃下干燥箱中干燥至恒重，粉碎，過40目篩，為試驗(yàn)用甜藤樣品原料。

對(duì)照品蘆?。?9.0%，中國生物制品檢驗(yàn)所）；乙醇、亞硝酸鈉、氯化鋁、氫氧化鈉，均為分析純；試驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.2 儀器

UV-2550 紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司），SK2510LHC型超聲波公司清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限），AR2140型電子分析天平（奧斯國際貿(mào)易（上海）有限公司），ZK-82A型真空干燥箱（上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠），TD5M型低速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司），WK-1000A小型高速粉碎機(jī)（青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司），其它玻璃儀器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取20.0 mg蘆丁對(duì)照品于小燒杯中用30%乙醇溶解，定量轉(zhuǎn)移至50 mL棕色量瓶中，定容，搖勻，配制成0.4 mg/ mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，避光保存，備用。

1.3.2 供試品溶液的制備

取甜藤莖（或葉）粉末約3 g，稱準(zhǔn)至0.001 g，按照液料比為25： 1（提取溶劑為蒸餾水），置于250 mL錐形瓶中，用保鮮膜蓋住瓶口，稱量并記下質(zhì)量，浸泡110 min，在超聲頻率59 kHz、功率100 W、水浴溫度為45 ℃下超聲提取60 min，取出，冷卻至室溫，再補(bǔ)重，將其轉(zhuǎn)移到離心管，離心10 min（4000 r/ min），過濾，取續(xù)濾液，靜置，避光保存，待測(cè)。

1.3.3 以水為提取溶劑，甜藤中總黃酮提取工藝優(yōu)化

取同一批次甜藤莖粉末約3 g，每份準(zhǔn)確至0.001 g，于250 mL錐形瓶中，按一定的液料比加入蒸餾水，混勻，蓋上保鮮膜，稱量，固定超聲頻率59 kHz和功率100 W下進(jìn)行超聲提取甜藤中水溶性黃酮類化合物。分別考察液料比、浸泡時(shí)間、超聲提取時(shí)間、超聲水浴溫度對(duì)黃酮類化合物提取效果的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，再進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化以水為溶劑超聲提取總黃酮的最佳工藝。

1.3.4 方法學(xué)考察

1.3.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定。用移液管精密量取蘆丁對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，分別置于25 mL容量瓶中，按1.3.4.2項(xiàng)下方法操作顯色后，在400 nm～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，以確定檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍試驗(yàn)。精密量取蘆丁對(duì)照品溶液（濃度為0.4 mg/ mL），0.00 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL于25 mL容量瓶，分別向其加入30%乙醇溶液至10 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置10 min，再加入10%氯化鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置10 min，再加入5%氫氧化鈉溶液4.0 mL，加入蒸餾水至刻度線，搖勻，靜置15 min。以0.00號(hào)作空白對(duì)照，于波長(zhǎng)515 nm處測(cè)吸光度，以蘆丁對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.3 精密度試驗(yàn)。取2.00 mL蘆丁對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為0.4 mg/ mL）于25 mL容量瓶中，按1.3.4.2項(xiàng)操作顯色后，于515 nm處重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)定吸光度值，計(jì)算吸光度值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD值）。

1.3.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。黃酮易被氧化，穩(wěn)定性試驗(yàn)為了確保實(shí)驗(yàn)誤差在允許的范圍。分別取甜藤葉、莖粉末約3 g，準(zhǔn)確稱定至0.001g，按1.3.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，用錫箔紙包裹裝有提取液的試劑瓶，避光保存于溫度為4 ℃冰箱中，分別在0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 、24.0 h下，每次量取供試品溶液3.00 mL置25 mL的容量瓶中，按1.3.4.2項(xiàng)方法操作顯色后于515 nm處測(cè)吸光度值，計(jì)算吸光度值的RSD。

1.3.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批樣品葉、莖粉末各3份，每份約3 g，按1.3.2項(xiàng)方法制備供試溶，取一定量供試溶按1.3.4.2項(xiàng)方法操作顯色后于515 nm處測(cè)吸光度值，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中總黃酮含量。

1.3.4.6 加樣回收率試驗(yàn)。取甜藤莖（或葉）樣品約3g，準(zhǔn)確稱定至0.001g，按1.3.2項(xiàng)制備提取液，取9支25 mL容量瓶，編號(hào)（1、2、3、4、5、6、7、8、9），向9支容量瓶中分別加入1.00 mL提取液，再向1、2、3號(hào)容量瓶中加入1.00 mL0.4 mg/ mL蘆丁對(duì)照品溶液，向4、5、6號(hào)容量瓶加入2.00 mL0.4 mg/ mL蘆丁對(duì)照品溶液，向7、8、9號(hào)容量瓶加入3.00 mL0.4 mg/ mL蘆丁對(duì)照品溶液，按1.3.4.2項(xiàng)下方法操作，于515 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算回收率。

1.3.5 樣品中水溶性總黃酮含量的測(cè)定

取甜藤樣品約3g，準(zhǔn)確稱定至0.001g，按1.3.2項(xiàng)制備提取液，按1.3.4.2項(xiàng)下方法操作，于515 nm處測(cè)定吸光度值，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中總黃酮的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 探究液料比對(duì)甜藤水溶性總黃酮提取效果的影響

室溫下浸泡30 min后，在水浴溫度為35 ℃，超聲提取時(shí)間40 min條件下，考察液料比對(duì)水溶性黃酮類化合物提取效果的影響，結(jié)果見如圖1，結(jié)果表明，液料比為20時(shí)黃酮得率最高，故選擇15、20、25三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2 探究浸泡時(shí)間對(duì)甜藤水溶性總黃酮提取效果的影響

按液料比為20，室溫下浸泡一定時(shí)間后，在水浴溫度為35 ℃，超聲提取時(shí)間40 min條件下，考察浸泡時(shí)間對(duì)水溶性黃酮類化合物提取效果的影響，結(jié)果見圖2，結(jié)果表明，浸泡時(shí)間60 min后黃酮得率趨于平緩，選擇以60min、90min、110min三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3 探究超聲時(shí)間對(duì)甜藤水溶性總黃酮提取效果的影響

按液料比為20，室溫下浸泡30 min后，在水浴溫度為35 ℃條件下，超聲提取一定時(shí)間，考察超聲時(shí)間對(duì)水溶性黃酮類化合物提取效果的影響，結(jié)果見圖3，超聲時(shí)間為80 min時(shí)黃酮得率最高，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮得率反而略有降低，可能因?yàn)槌晻r(shí)間較長(zhǎng)局部溫度過高，導(dǎo)致穩(wěn)定性較差的黃酮成分被破壞。選擇60 min、80 min、100 min三個(gè)水平做正交試驗(yàn)。

2.1.4 探究超聲水浴溫度對(duì)甜藤水溶性總黃酮提取效果的影響

按液料比為20，室溫下浸泡30 min后，在一定水浴溫度下，超聲提取40 min，考察超聲水浴溫度對(duì)水溶性黃酮類化合物提取效果的影響，結(jié)果見圖4，從圖可見，水浴溫度為55 ℃時(shí)黃酮得率最高，隨著水浴溫度的升高，黃酮得率逐漸下降，說明有些黃酮成分高溫時(shí)穩(wěn)定性降低。選擇以45 ℃、55 ℃、65 ℃三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)

通過以上單因素試驗(yàn)對(duì)甜藤水溶性總黃酮提取效果探究上，以液料比（A）、浸泡時(shí)間（B）、超聲時(shí)間（C）、水浴溫度（D）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)因素如表1，正交試驗(yàn)結(jié)果如表2。

由表2，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果并進(jìn)行極差分析，四個(gè)因素對(duì)甜藤水溶性黃酮提取效果影響依次為：水浴溫度（D）> 液料比>（A）浸泡時(shí)間（B）> 超聲時(shí)間（C）。通過正交試驗(yàn)直觀的分析，提取甜藤總黃酮最佳條件為A3B3C1D1，即為液料比為25 ： 1、浸泡時(shí)間為110 min、超聲時(shí)間為60 min、水浴溫度為45 ℃。

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定。結(jié)果對(duì)照品蘆丁溶液經(jīng)顯色后在515 nm處有最大吸收，供試品溶液經(jīng)顯色后在515 nm處也有較強(qiáng)的吸收，故確定515 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，以提高測(cè)定結(jié)果的靈敏度。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍試驗(yàn)。以吸光度值（A）對(duì)蘆丁對(duì)照品質(zhì)量濃度（C）的進(jìn)行線性回歸，其方程為A = 10.057 C+0.0026，r=0.9997， 說明蘆丁對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度在0.016～0.048 mg /mL范圍內(nèi)與吸光值具有良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn)。測(cè)得吸光度值的RSD為0.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。分別測(cè)得吸光度值的RSD為2.6%（葉）、1.9%（莖），表明葉和莖的提取溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)。以黎平產(chǎn)甜藤為供試品（9月份采），測(cè)得甜藤葉、莖中水溶性總黃酮得率分別為2.23%、0.22%；RSD分別為2.8%、1.5%。表明方法的重現(xiàn)性較好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)。用甜藤葉加樣回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表4，結(jié)果的RSD = 3.26%。用同樣方法，測(cè)得甜藤莖樣品加樣回收試驗(yàn)，結(jié)果的RSD = 2.17%，表明測(cè)定方法的準(zhǔn)確度比較高。

2.4 樣品含量的測(cè)定

2.4.1 黔東南不同地方甜藤莖中水溶性總黃酮的含量

2016年2月采甜藤莖樣品，按前述方法處理樣品、提取及測(cè)定，結(jié)果見表4。

由表4結(jié)果可知，同季節(jié)不同產(chǎn)地的甜藤莖中水溶性總黃酮的含量差異較大，從江甜藤莖中水溶性總黃酮的含量最高為0.71%。

2.4.2 不同采收期甜藤莖樣品的總黃酮含量變化

采集黎平產(chǎn)地不同采收期（每月中旬采集）的甜藤莖，按前述方法處理樣品、提取及測(cè)定，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，在一年的生長(zhǎng)期中，甜藤莖中水溶性總黃酮含量在12月初～1月中旬達(dá)到最高為0.79 %，含量最高，從1 ～ 7月持續(xù)下降，最低值為0.11 %；又從8～12月持續(xù)上升。其中，2 ～ 5月和6 ～ 9月的黃酮含量差異不大，趨勢(shì)圖平緩。通過試驗(yàn)得出，以水溶性黃酮含量為標(biāo)準(zhǔn)，甜藤莖最佳采收期應(yīng)為12月至1月。

2.4.3 甜藤不同部位的水溶性總黃酮含量比較

取同一產(chǎn)地同采收期（9月份）不同部位的甜藤樣品，按前述方法處理樣品、提取及測(cè)定，結(jié)果見表5。

3 結(jié)論與討論

（1）以水為提取溶劑，超聲提取甜藤莖中水溶性總黃酮的最佳條件是：液料比為25 ： 1、浸泡時(shí)間為110 min、超聲時(shí)間為60 min、水浴溫度為45 ℃。此條件下測(cè)得黔東南部分地區(qū)（主要是侗族地區(qū)）野生甜藤中水溶性總黃酮得率，結(jié)果顯示，不同地方含量不同，以從江、榕江及黎平的含量較高。黃酮類化合物受環(huán)境因素影響較大，光照條件是主要因素，受光越充足，黃酮含量越高，從江、榕江及黎平位于黔東南的南部年均日照時(shí)較其他地方要長(zhǎng)。

（2）不同季節(jié)甜藤中水溶性總黃酮的含量不同，12月采集的甜藤莖黃酮的含量最高。分析其原因主要是：一方面，甜藤是一種蔓性草質(zhì)藤本植物，生長(zhǎng)初莖部色綠柔軟，可以進(jìn)行光合作用和次生代謝，從而參與植株到代謝過程，形成的次生代謝產(chǎn)物較多，故此時(shí)莖部的黃酮含量較高，但隨著植株的生長(zhǎng)，逐漸木質(zhì)化，不再或很少參與到植株的代謝過程，因此從1月份開始至9月時(shí)，其含量也隨著逐漸降低，同時(shí)全株為滿足生長(zhǎng)的需要，形成的初生代謝產(chǎn)物主要提供給其營養(yǎng)生長(zhǎng)，初生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為次生代謝產(chǎn)物（如黃酮）的量相對(duì)較少，故6月～9月是黃酮含量的低谷期；到了秋冬季節(jié)，各組織發(fā)育成熟，植株生長(zhǎng)緩慢，光合作用、呼吸作用變?nèi)?，次生代謝物很少或沒有發(fā)生轉(zhuǎn)移或降解，卻累積在莖部組織中，故使黃酮含量逐漸升高，另一方面，黃酮在植物中的積累還受光照時(shí)長(zhǎng)、溫度等影響較大，夏季光照最強(qiáng)，黃酮合成逐漸積累，從9月～12月甜藤中的黃酮含量明顯持續(xù)上升，從而形成12月黃酮含量的高峰期。

（3）甜藤葉、果、莖中水溶性總黃酮含量差別較大，葉>果>莖。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，這與各部位的光合作用強(qiáng)度有關(guān)，葉受光充足且光合作用強(qiáng)，與文獻(xiàn)研究結(jié)論一致。

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