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    辛伐他汀對慢性心力衰竭兔心肌PPARγ mRNA、蛋白表達(dá)及核因子κB表達(dá)、活性的影響

    2010-12-14 06:21:32齊洪濤劉志華趙彩明李紅霞韓蓮花蔣庭波宋建平蔣文平
    中國藥理學(xué)通報 2010年1期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞核辛伐他汀左室

    齊洪濤,劉志華,蔣 彬,鄒 操,趙彩明,李紅霞,韓蓮花,蔣庭波,宋建平,蔣文平

    (1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科,江蘇蘇州 215006;2.青島大學(xué)第二附屬醫(yī)院心功能科,山東青島 266042)

    過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators activated receptor,PPAR)是核甾體激素受體,能被脂肪酸以及外源性過氧化體增殖物激活劑激活,調(diào)控參與脂類代謝的某些酶的基因表達(dá)[1],同時PPARs的激活對一些細(xì)胞的生長、分化、凋亡有重要影響[2]。最近的研究顯示PPARγ對心肌肥厚具有抑制作用,PPARγ激活能改善左室重構(gòu)和恢復(fù)心功能,抑制心肌細(xì)胞肥大和纖維化。PPARγ滅活,導(dǎo)致心肌肥厚。PPARγ對心室重構(gòu)的影響,主要與降低核因子 κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的活性有關(guān)。NF-κB是一種具有基因轉(zhuǎn)錄多向調(diào)控作用的核轉(zhuǎn)錄因子,在心肌肥厚、心肌細(xì)胞凋亡、心力衰竭的發(fā)生中,NF-κB發(fā)揮重要作用,NF-κB的過分表達(dá)導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。近期研究證明,PPARγ對NF-κB有負(fù)向調(diào)節(jié)關(guān)系[3],他汀類藥物對PPARγ有激活作用,并通過激活PPARγ抑制NF-κB活性,抑制心肌肥厚[4,5]。本研究觀察了辛伐他汀對PPARγ mRNA及蛋白表達(dá)的影響,及辛伐他汀對NF-κB亞基p65蛋白表達(dá)及活性的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 24只新西蘭白兔均來自蘇州大學(xué)實驗動物中心,♀♂不拘,體重1.8~2.8 kg,分為4組,每組6只,1組:假手術(shù)組;2組:心衰對照組,術(shù)后觀察8 wk。3組:早干預(yù)組,手術(shù)后給予辛伐他汀(Merck Sharp&Dohme Ltd產(chǎn)品,杭州默沙東公司分裝)5 mg·kg-1·d-1,采用灌胃方法給藥,連續(xù)服8 wk。4組:晚干預(yù)組,術(shù)后4 wk給予辛伐他汀5 mg·kg-1·d-1,灌胃方法給藥,連續(xù)4 wk。

    1.2 心臟前后負(fù)荷增加模型制作 通過破壞主動脈瓣造成主動脈瓣返流,2 wk后實施腹主動脈縮窄術(shù),制作前、后符合增加心力衰竭模型[6]。心臟超聲檢查:于主動脈瓣破壞后及觀察結(jié)束時,做心臟超聲檢查,用12 Hz專用探頭,做M超及彩色多普勒超聲,觀察左心室內(nèi)徑及室壁厚度、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室長軸縮短率(FS),破瓣后主動脈瓣返流情況。實驗觀察終止時,再次手術(shù),分離另一側(cè)頸總動脈,測量左室舒張末壓。取出心臟稱全心及左室重量,計算心臟重量/體重、左室重量/體重。左心室組織放液氮中儲存。

    1.3 測定蛋白濃度 用德國Merck KgaA ProteoExtract?Subcellular proteome Extraction Kit提取心肌組織細(xì)胞核蛋白。Bradford蛋白濃度測定試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)測定蛋白濃度。

    1.4 Western blot檢測細(xì)胞核PPARγ、p65蛋白表達(dá) PPARγ、p65蛋白分子量均為65 ku,配制10%分離膠。膠凝固后,配制5%的濃縮膠。分別取80 μg細(xì)胞膜蛋白加5×上樣緩沖液2 μl,沸水變性5 min。將樣品蛋白及預(yù)染蛋白Marker加入上樣孔,電泳、轉(zhuǎn)膜。免疫反應(yīng):用封閉液稀釋一抗到要求濃度,抗 PPARγ(5 mg·L-1),抗 p65(10 mg·L-1),抗β-actin(1∶500)。將膜放入一抗稀釋液中,4℃孵育過夜。將膜放入二抗稀釋液,室溫下在搖床上孵育1 h。化學(xué)發(fā)光,顯影,定影。圖像分析用掃描儀將X光片圖像掃至電腦,用UVIDoc軟件進(jìn)行條帶灰度分析,計算每標(biāo)本PPARγ、p65與β-actin灰度比。

    1.5 RT-PCR檢測心肌組織PPARγ mRNA表達(dá)每一標(biāo)本取100 mg心肌組織,用TRIzol提取mRNA,室溫干燥,測A260/A280值。用美國Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒做逆轉(zhuǎn)錄。擴(kuò)增:將PCR管置于冰上,建立下列反應(yīng)體系:10 × buffer 2.5 μl,MgCl22 μl,Tag 酶 0.25 μl,dNTP 0.5 μl,10 mmol·L-1引物(S)0.625 μl,10 mmol·L-1(A)0.625 μl,模板 2 μl,加DEPC 水至25 μl。引物:PPARγ 上游:5′-TTCCTGTCAAGATCGCCCTCG-3′;下 游:5′-TGGGGATGTCTCATAATGCCA-3′。β-actin 上游:5′-GTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGG-3′;下游:5′-CTTCTCCTTGATGTCCCGCACGAT-3′。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4 min,然后,94℃變性 1 min,55℃退火1 min,72℃延長1 min 20 s,35個循環(huán),72℃延伸10 min。電泳及圖像分析:用Bio Rad凝膠成像系統(tǒng)quantity one軟件分析條帶灰度,計算每一樣本PPARγ mRNA灰度與βactin mRNA灰度比。

    1.6 電泳遷移率變動試驗(EMSA)檢測心肌細(xì)胞核p65活性 用Subcellular proteome Extraction Kit(Merck KgaA ProteoExtract?,German)提取細(xì)胞核蛋白。用含NF-κB核苷酸同序列(5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′)結(jié)合位點的寡核苷酸完成電泳遷移率變動試驗。在下列反應(yīng)中完成寡核苷酸標(biāo)記:2 μl寡核苷酸(1.75 pmol/Al),2 μl T4 多核苷酸激酶緩沖液,1 μl T4多核苷酸激酶(10 U/Al),2.5 μl[γ-32P]ATP(185 TBq/mmol at 370 MBq/ml),37℃孵育1 h。加入90 μl TE 緩沖液(10 mmol·L-1Tris-HCl pH 7.4 and 1 mmol·L-1EDTA)。10 μg核蛋白在冰上加入緩沖液(10 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0,25 mmol·L-1KCl,0.5 mmol·L-1DTT,0.1 mmol·L-1EDTA pH 8.0,5%glycerol,5 g·L-1BSA,100 mg·L-1tRNA and 50 mg·L-1poly(dI-dC)),反應(yīng) 10 min,然后加入 15 μl標(biāo)記探針(約60.000 cpm),4℃孵育15 min。同時完成特異性競爭試驗。在標(biāo)記探針加入前先加入未標(biāo)記同序列競爭核苷酸。在標(biāo)記探針4℃孵育前加入p65抗體,然后將蛋白-DNA復(fù)合物4℃ 5%的聚丙酰胺電泳,將膠放在濾紙上,干燥后,用磷屏壓膠1 h,用磷屏掃描儀檢測32P放射量,掃描磷屏,用ImageQuant軟件分析各標(biāo)本圖像中32P放射量。

    2 結(jié)果

    2.1 4組心臟、左心室重量及心臟/體重、左心室/體重比較 心力衰竭對照組心臟重量、左心室重量、心臟重量指數(shù)、左心室重量指數(shù)均大于假手術(shù)組,早干預(yù)組上述指標(biāo)均低于心力衰竭對照組,晚干預(yù)組心臟重量、左心室重量、心臟重量指數(shù)低于心力衰竭對照組,見Tab 1。

    2.2 4組觀察開始及結(jié)束時左室最大舒張壓比較實驗開始時,各組左室舒張末壓(LVEP)無差異。實驗終止時,心衰對照組高于假手術(shù)組,早、晚干預(yù)組LVEP均低于心衰對照組,見Tab 2。

    Tab 2 Change after heart failure and effect of simvastatin on LVEDP±s,n=6)

    Tab 2 Change after heart failure and effect of simvastatin on LVEDP±s,n=6)

    **P<0.01 vs groupⅡ;ΔΔP<0.01 vs groupⅠ

    GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣbegin of experiment -2.50±1.41 -3.00±1.65 -2.00±0.63 -2.50±1.52 end of experiment -0.50±1.34** 14.00±2.67ΔΔ 0.33±1.97**2.33±1.89**

    2.3 4組心肌組織PPARγ mRNA表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較,心力衰竭組PPARγ mRNA表達(dá)降低,辛伐他汀干預(yù)后,PPARγ mRNA表達(dá)明顯增加,且早干預(yù)組表達(dá)增加比晚干預(yù)組更加明顯,見Tab 3及Fig 1。

    Tab 3 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear PPARγ mRNA expression(±s,n=6)

    Tab 3 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear PPARγ mRNA expression(±s,n=6)

    **P<0.01 vs groupⅠ;△△P<0.01 vs groupⅡ;#P<0.05 vs groupⅣ

    GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣPPARγ mRNA 0.720±0.018 0.308±0.010**0.522±0.009△△#0.448±0.024△△

    2.4 4組心肌組織細(xì)胞核PPARγ蛋白表達(dá)的比較

    心衰組PPARγ表達(dá)低于健康對照組,經(jīng)辛伐他汀治療后,早干預(yù)組及晚干預(yù)組PPARγ蛋白表達(dá)增加(P<0.01,P<0.01)。早干預(yù)組PPARγ蛋白表達(dá)比晚干預(yù)組增加明顯,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見Tab 4,F(xiàn)ig 2。

    Fig 1 RT-PCR of cardiomyocyte nuclear PPARγ mRNA expression in four groups(n=6)

    Tab 4 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear PPARγ protein expression(±s,n=6)

    Tab 4 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear PPARγ protein expression(±s,n=6)

    **P<0.01 vs groupⅠ;△△P<0.01 vs groupⅡ

    GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣPPARγ protein 0.819±0.038 0.403±0.016**0.638±0.017△△0.587±0.021△△

    Fig 2 Western Blot of cardiomyocyte nuclear PPARγ protein expression in four groups(n=6)

    2.5 4組心肌組織細(xì)胞核NF-κB亞基p65蛋白表達(dá)的比較 心力衰竭組心肌細(xì)胞和中p65表達(dá)明顯增加,辛伐他汀干預(yù)后p65表達(dá)降低,早干預(yù)組表達(dá)比晚干預(yù)組降低更明顯,但未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義,見Tab 5,F(xiàn)ig 3。

    Tab 5 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear p65 protein expression( ± s,n=6)

    Tab 5 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear p65 protein expression( ± s,n=6)

    **P<0.01 vs groupⅠ;△△P<0.01 vs groupⅡ

    GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣp65 0.417±0.013 0.715±0.038**0.491±0.015△△0.537±0.032△△

    Tab 1Changes after heart failure and effects of simvastatin on HW,LVW,HW/BW radio and LVW/BW(±s,n=6)

    Tab 1Changes after heart failure and effects of simvastatin on HW,LVW,HW/BW radio and LVW/BW(±s,n=6)

    *P<0.05,**P <0.01 vs groupⅡ;ΔΔP<0.01 vs groupⅠ

    GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣHeart weight/g 4.95±0.42** 11.02±0.53ΔΔ 6.07±0.55** 8.45±0.41*LV weight/g 3.52±0.35** 7.67±0.34ΔΔ 4.19±0.38** 6.29±0.36**HW/BW radio/g·kg-1 2.40±0.23** 4.45±0.35ΔΔ 2.73±0.27** 3.32±0.17*LVW/BW/g·kg-1 1.70±0.20** 3.12±0.28ΔΔ 1.87±0.13**2.47±0.15

    Fig 3 Western Blot of cardiomyocyte nuclear p65 protein expression in four groups(n=6)The p65 protein expression of cardiomyocyte nuclear was increased in failure heart(groupⅡ),simvastatin inhibited the p65 protein expression of cardiomyocyte nuclear(groupⅢ,groupⅣ)

    2.6 4組心肌組織細(xì)胞核NF-κB亞基p65活性比較 心力衰竭組心肌細(xì)胞核p65活性明顯增強,給予辛伐他汀干預(yù)后p65活性明顯降低,早干預(yù)組表達(dá)降低比晚干預(yù)組更加明顯,見Tab 6,F(xiàn)ig 4。

    Tab 6 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear p65 activity(±s,n=6)

    Tab 6 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear p65 activity(±s,n=6)

    **P<0.01 vs groupⅠ;△△P<0.01 vs groupⅡ;#P<0.05 vs groupⅣ

    GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣp65 2464.97±130.09 6922.76±358.44**2897.18±263.71△△#4368.54±180.62△△

    Fig 4 EMSA of cardiomyocyte nuclear p65 activity in four groups(n=6)The p65 activity of cardiomyocyte nuclear was increased in failure heart(groupⅡ),simvastatin inhibited the p65 activity of cardiomyocyte nuclear(groupⅢ,groupⅣ)

    3 討論

    成年心臟心肌代謝主要依靠線粒體氧化長鏈脂肪酸,參與脂肪氧化酶的基因受PPARs調(diào)節(jié)[7]。最近的研究發(fā)現(xiàn),心肌肥厚與心肌代謝發(fā)生改變、脂肪氧化減少,葡萄糖氧化增加有關(guān),而這樣的代謝為胎兒心肌的代謝特點。這一變化被認(rèn)為是為減少耗氧而發(fā)生的適應(yīng)性反應(yīng),但因受損的脂肪酸氧化而導(dǎo)致脂質(zhì)在心臟沉積,并導(dǎo)致心肌肥厚[8]。

    許多研究顯示PPARγ對心肌肥厚、心肌纖維化具有抑制作用,抑制細(xì)胞表面積增大及心肌肥厚相關(guān)基因的表達(dá)。抑制心肌肥厚及間質(zhì)纖維化,改善心肌重構(gòu)。Yuan等[9]在大鼠中研究顯示,PPARγ抑制心肌細(xì)胞增長、胚胎基因表達(dá),并抑制NF-κB的活性。Yamamoto等[10]在研究中也發(fā)現(xiàn),PPARγ激活抑制NF-κB激活,抑制心肌肥厚發(fā)生。

    核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是一種具有基因轉(zhuǎn)錄多向調(diào)控作用的核轉(zhuǎn)錄因子,NF-κB存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞,在心肌肥厚、心肌細(xì)胞凋亡、心力衰竭的發(fā)生中,發(fā)揮重要作用[11]。內(nèi)分泌-細(xì)胞因子引起的心室重構(gòu)、心室肥厚的信號通路最終都經(jīng)過NF-κB[12]。

    近期研究證明[13],他汀類藥物對抑制心室重構(gòu),改善心功能有重要作用,其機(jī)制與激活PPARγ[14,15],抑制 NF-κB 活性有關(guān)。Delerive 等[15]在研究中發(fā)現(xiàn),PPARα與NF-κB亞單位p65第12-317號氨基酸有弱的相互作用,通過蛋白-蛋白作用,PPARα 對 NF-κB 產(chǎn)生抑制作用。Planavila等[16]研究也發(fā)現(xiàn),在壓力負(fù)荷增加導(dǎo)致的心肌肥厚過程中,Atorvastatin干預(yù)抑制了NF-κB激活,并防止了PPARs蛋白表達(dá)降低,抑制心肌肥厚的發(fā)生。

    與以往研究結(jié)果相似[5,15],本研究結(jié)果顯示在壓力負(fù)荷及容量負(fù)荷增加導(dǎo)致的心力衰竭心肌組織中,心肌細(xì)胞核PPARγ蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯減少,RT-PCR分析顯示心力衰竭心肌組織細(xì)胞核中PPARγ mRNA表達(dá)降低,而心肌細(xì)胞核NF-κB亞基p65蛋白表達(dá)增加,電泳移動轉(zhuǎn)變分析(EMSA)顯示,心力衰竭心肌組織中,p65活性較健康對照明顯增強。表明PPARγ表達(dá)減少,對心肌肥厚的抑制作用減弱,導(dǎo)致心肌肥厚發(fā)生,p65表達(dá)增加、活性增強是心肌肥厚的重要原因,PPARγ與p65存在負(fù)向調(diào)節(jié)關(guān)系。辛伐他汀干預(yù)后 PPARγ mRNA、蛋白表達(dá)增加,細(xì)胞核p65表達(dá)減少,活性降低,表明辛伐他汀通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄,提高PPARγ表達(dá),PPARγ表達(dá)增加抑制p65表達(dá)及活性,從而對心肌肥厚產(chǎn)生影響。比較早干預(yù)組與晚干預(yù)組發(fā)現(xiàn),早干預(yù)使PPARγ mRNA表達(dá)增加比晚干預(yù)組更加明顯,且早干預(yù)組對p65活性抑制比晚干預(yù)組更強。

    [1]Schoonjans K,Martin G,Staels Auwerx J.Peroxisome proliferatoractivated receptors,orphans with ligands and functions[J].Curr Opin Lipidol,1997,8(3):159-66.

    [2]Chawla A,Repa J J,Evans R M,et al.Nuclear receptors and lipid physiology:opening the X-files[J].Science,2001,294(5548):1866-70.

    [3]Purcell N H,Tang G L,Yu C F,et al.Activation of NF-kappa B is required for hypertrophic growth of primary rat neonatal ventricular cardiomyocytes[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(12):6668-73.

    [4]Higuchi Y,Otsu K,Nishida S,et al.Involvement of reactive oxygen species-mediated NF-kappa B activation in TNF-alpha-induced cardiomyocyte hypertrophy[J].J Mol Cell Cardiol,2002,34(2):233-40.

    [5]Asakawa M,Takano H,Nagai T,et al.Perexisome proliferator-activated receptor γ plays a critical role in inhibition of cardiac hypertrophyin vitroandin vivo[J].Circulation,2002,105(10):1240-46.

    [6]鄒 操,劉志華,趙彩明,等.超容量負(fù)荷聯(lián)合壓力負(fù)荷制備家兔心衰模型的可行性探討[J].實驗動物與比較醫(yī)學(xué),2005,4(25):248-54.

    [6]Zou C,Liu Z H,Zhao C M,et al.A model of heart failure induced by volume plus pressure overload in rabbits[J].Lab Anim Comp Med,2005,4(25):248-54.

    [7]Tian Q,Barger P M.Deranged energy substrate metabolism in the failing heart[J].Curr Hypertens Rep,2006,8(6):465-71.

    [8]Barger P M,Brandt J M,Leone T C,et al.Deactivation of peroxisome proliferator-activated receptor-alpha during cardiac hypertrophic growth[J].J Clin Invest,2000,105(12):1723-30.

    [9]Yuan Z,Liu Y,Liu Y,et al.Cardioprotective effects of peroxisome proliferator activated receptor γ activators on acute myocarditis:anti-inflammatory actions associated with nuclear factor kB blockade[J].Heart,2005,91(9):1203-8.

    [10]Yamamoto K,Ohki R,Lee R,et al.Peroxisome proliferator-activated receptorγ activators inhibit cardiac hypertrophy in cardiac myocytes[J].Circulation,2001,104(14):1670-5.

    [11]Hirotani S,Otsu K,Nishida K,et al.Involvement of nuclear factor-Kappa B and apoptosis signal-regulating kinase 1 in G-proteincoupled receptor agonist-induced cardiomyocyte hypertrophy[J].Circulation,2002,105(4):509-15.

    [12]Li Y,Ha T,Gao X,et al.NF-κB activation is required for the development of cardiac hypertrophyin vivo[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2004,287(4):H1712-20.

    [13]胥雪蓮,覃 數(shù),雷 寒,等.辛伐他汀改善大鼠心肌梗死后心室重塑與 p-ERK1/2的關(guān)系[J].中國藥理學(xué)通報,2008,24(2):258-61.

    [13]Xu X L,Qin S,Lei H,et al.Simvastatin ameliorates rat ventricular remodeling after myocardial infarction:the role of phosphorylating extracellular signal-regulated kinase1/2[J].Chin Pharmacol Bull,2008,24(2):258-61.

    [14]Planavila A,Laguna J C,V?zquez-Carrera M.Atorvastatin improves peroxisome proliferator-activated receptor signaling in cardiac hypertrophy preventing nuclear factor-κB activation[J].Biochim Biophys Acta,2005,1687(1-3):76-83.

    [15]Delerive P,De Bosscher K,Sandrine B,et al.Peroxisome proliferator-activated receptor a negatively regulates the vascular inflammatory gene response by negatively regulates the vascular inflammatory gene response by negative cross-talk with transcription factors NF-κB and AP-1[J].J Biol Chem,1999,5274(45):32048-54.

    [16]Planavila A,Rodriguez-Calvo R,Jove M,et al.Peroxisome proliferator-activated receptor beta/delta activation inhibits hypertrophy in neonatal rat cardiomyocytes[J].Cardiovasc Res,2005,65(4):832-41.

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