羥乙基淀粉130/0.4不同復(fù)蘇方案對(duì)失血性休克大鼠肺損傷的早期影響及機(jī)制

劉華琴，李 勇，劉向東，邢玉英，付建峰，王士杰

容量治療是失血性休克的主要治療措施之一。在血源緊張或匱乏的情況下，血漿擴(kuò)容劑的選擇要考慮在滿足重要器官有效灌注的前提下，降低肺、腎等易損臟器的程度。6%羥乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)130/0.4是目前最接近理想狀態(tài)的擴(kuò)容劑［1］，日益廣泛的應(yīng)用于各種休克患者的容量治療。失血性休克后急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。研究表明晶體液和全血復(fù)蘇能糾正失血性休克患者血容量的丟失，增加心臟的充盈量和每搏量，減少血管活性藥的用量，維持有效的動(dòng)脈血壓;但高達(dá)80% ～85%患者出現(xiàn)乳酸血癥及混合靜脈血氧飽和度降低，表明血壓、心率，尿量等回復(fù)正常，但肺組織等的低灌注仍未得到改善［2］。HES130/0.4能更好的改善微循環(huán)，能減輕內(nèi)毒素性肺損傷［3～6］，但對(duì)失血性休克后非感染性肺部炎性損傷的作用尚無(wú)定論。本研究通過(guò)動(dòng)脈放血法復(fù)制失血性休克模型，觀察不同劑量的HES130/0.4復(fù)合林格液復(fù)蘇對(duì)大鼠ALI的早期影響及外周血白細(xì)胞CD11b和CD18的表達(dá)加以探討。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 健康清潔級(jí)♂成年SD大鼠24只，體重220～300 g，河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，2 h禁飲，實(shí)驗(yàn)室溫度控制在20℃～23℃，相對(duì)濕度0.45～0.55，環(huán)境清潔。24只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、林格液組(RS組)、HES 33 ml·kg－1復(fù)蘇組(H1 組)、HES 50 ml·kg－1復(fù)蘇組(H2 組)，每組6 只。

1.2 試劑 6%羥乙基淀粉130/0.4(批號(hào):TM7302，F(xiàn)resenius公司，德國(guó))，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的抗CD11b和抗CD18抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的小鼠 IgGk和IgA1以及溶血素(BD公司，美國(guó))。

1.3 失血性休克模型的復(fù)制 腹腔注射1%戊巴比妥鈉45 mg·kg－1麻醉后分離右頸總動(dòng)脈、左股靜脈。左股靜脈連接24號(hào)套管針輸液用，右頸總動(dòng)脈置入連有三通的22號(hào)套管針連接SurgiVet?監(jiān)護(hù)儀(V9200型，美國(guó))，供放血和監(jiān)測(cè)血壓。動(dòng)、靜脈穿刺成功后，穩(wěn)定15 min，經(jīng)頸總動(dòng)脈放血(15 min內(nèi))，通過(guò)間斷放血和自體血回輸使平均動(dòng)脈壓(MAP)降至35～45 mmHg，維持90 min。假手術(shù)組(sham組)僅麻醉及進(jìn)行動(dòng)靜脈穿刺，不放血。林格液組(RS組)用3倍最大放血量的林格液復(fù)蘇，H1、H2組分別用相應(yīng)的羥乙基淀粉和林格液復(fù)蘇(各組復(fù)蘇所用林格液的量為3倍最大的放血量減去相應(yīng)劑量的羥乙基淀粉)，復(fù)蘇時(shí)間為45 min。

1.4 指標(biāo)觀察 ①記錄各組的最大放血量以及休克前(T0)，復(fù)蘇前(T1)，復(fù)蘇結(jié)束后即刻(T2)，復(fù)蘇后1(T3)、2(T4)、3(T5)h的MAP(假手術(shù)組于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn));② 分別于 T0、T1、T4、T5時(shí)間點(diǎn)經(jīng)頸總動(dòng)脈采血0.5 ml行血?dú)夥治?。?分別于T5(對(duì)照組于相應(yīng)時(shí)間)時(shí)間點(diǎn)用動(dòng)脈放血法處死動(dòng)物，迅速取相同部位的部分右肺組織固定于2.5%戊二醛磷酸緩沖液中，透射電鏡下觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)變化。④ 分別于T0、T1、T4、T5時(shí)間點(diǎn)取動(dòng)脈血，肝素抗凝，測(cè)定外周血白細(xì)胞CD11b和CD18的表達(dá)。將全血50 μl分別與 0.5 g·L－1FITC 標(biāo)記的抗 CD11b或抗CD18抗體和0.5 g·L－1FITC標(biāo)記的小鼠IgGk和IgA1各1 μl室溫避光孵育20 min。以溶血素破壞紅細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，1 500 r·min－1離心5 min，用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組CD11b和CD18抗體的熒光強(qiáng)度，反映CD11b和CD18的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SAS 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用ˉ±s表示，組間比較用單因素方差分析;組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 HES130/0.4復(fù)蘇效果的比較 各液體復(fù)蘇組最大放血量、放血量占全身總血量的百分比組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各組MAP差異放血前無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，復(fù)蘇后各時(shí)點(diǎn)MAP組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 HES130/0.4復(fù)蘇對(duì)血?dú)夥治鼋Y(jié)果的影響與sham組比較，各液體復(fù)蘇組于T1時(shí)間點(diǎn)PaO2升高，T1～5PaCO2均降低(P<0.05);與 T0比較，各液體復(fù)蘇組PaO2于T1時(shí)間點(diǎn)、H1組T1～5時(shí)間點(diǎn)、H2組T5時(shí)間點(diǎn)升高;PaCO2各液體復(fù)蘇組T1～5時(shí)間點(diǎn)降低;除H1組外，各液體復(fù)蘇組pH于T4、5時(shí)間點(diǎn)降低(P<0.05);見(jiàn)Tab 1。

2.3 HES130/0.4復(fù)蘇對(duì)肺組織超微結(jié)構(gòu)的影響Sham組肺血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，氣血屏障連續(xù)(見(jiàn)Fig 1);RS組肺組織超微結(jié)構(gòu)受損，血管內(nèi)皮基底膜斷裂，氣血屏障結(jié)構(gòu)模糊，水腫增厚，Ⅱ型上皮細(xì)胞微絨毛明顯減少，胞質(zhì)有空泡，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，可見(jiàn)顆粒融合現(xiàn)象，肺泡腔內(nèi)有紅細(xì)胞(見(jiàn)Fig 2);H1組除線粒體結(jié)構(gòu)輕微改變外基本接近正常(見(jiàn)Fig 3);H2組Ⅱ型細(xì)胞基本正常，核周間隙輕度擴(kuò)張，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，有脫顆粒(見(jiàn)Fig 4)。

2.4 HES130/0.4復(fù)蘇對(duì)大鼠外周血白細(xì)胞CD11b和CD18表達(dá)水平的影響 與sham組比較，各液體復(fù)蘇組于T1、T4、T5時(shí)間點(diǎn)CD11b和CD18的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05);與RS組比較，H1、H2組于T4、T5時(shí)間點(diǎn)CD11b和CD18的表達(dá)降低(P<0.05);與H1組比較，H2組于T4、T5時(shí)間點(diǎn)CD11b和CD18的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05);見(jiàn)Tab 2。

Tab 1 Effect of HES130/0.4 resuscitation on blood gas analysis in hemorrhagic shock rats(ˉ±s，n=6)

Tab 1 Effect of HES130/0.4 resuscitation on blood gas analysis in hemorrhagic shock rats(ˉ±s，n=6)

*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs RS group;△P<0.05 vs H1 group;☆P<0.05 vs T0

Group PO2/mmHg PCO2/mmHg pH BE/mmol·L －1 Sham T098±10 43.4±2.4 7.414±0.035 －0.7±1.9 T1 100±9 39.6±1.9 7.368±0.029 －0.5±1.4 T4 106±10 42.4±2.5 7.369±0.031 －1.0±1.1 T5 104±9 43.4±1.8 7.401±0.019 －0.9±1.3 RS T0 93±9 41.5±2.0 7.386±0.012 －0.9±1.7 T1 128±8*☆ 33.4±2.2*☆ 7.401±0.025 －4.4±3.0*☆T4 89±8 25.8±3.2*☆ 7.304±0.038*☆ －6.4±2.0*☆T5 85±7 30.9±4.0*☆ 7.295±0.026*☆ －6.9±2.8*☆H1 T0 86±9 42.8±3.3 7.391±0.025 －0.3±1.7 T1 121±10*☆ 32.8±2.3*☆ 7.489±0.028☆ －4.9±2.3*☆T4 108±10#☆ 30.8±1.7*#☆ 7.389±0.037# －6.0±1.3*☆T5 98±9#☆ 31.2±3.3*☆ 7.432±0.025# －3.7±2.0*#☆H2 T0 96±7 43.5±3.0 7.377±0.041 －1.1±1.7 T1 118±8*☆ 32.4±1.8*☆ 7.391±0.030☆ －5.2±3.1*☆T4 102±7# 33.1±1.3*#☆ 7.500±0.040*#△☆ －5.4±2.3*☆T5 87±6△☆ 32.9±2.6*☆ 7.518±0.045*#△☆ －2.3±1.0#

Fig 1 Normal the ultrastructure in sham group(×4 000). Fig 2In Ringer's group typeⅡ cell damaged severely，microvilli decreased obviously，vacuole and cell edema，large amount of erythrocyte and macrophage in alveolar space observed. Fig 3 Mitochondria changed slightly in H1 group. Fig 4 Perinuclear space dilated slightly，rough endoplasmic reticulum expanded slightly，and degranulation observed in H2 group

3 討論

本研究結(jié)果表明，失血性休克復(fù)蘇大鼠PaO2不同程度降低，且肺組織超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)典型的病理?yè)p傷改變，表明肺損傷模型建立成功。由于HES130/0.4具有更大的安全性［1］，每日最大劑量由33 ml·kg－1改為 50 ml·kg－1，甚至有學(xué)者應(yīng)用到 70 ml·g－1［7］，故本研究選用 33、50 ml·kg－1劑量;此外考慮到復(fù)蘇總量的一致以及晶體和膠體的配合使用，本研究復(fù)合不同劑量的林格液加以探討。由于休克本身造成組織缺氧以及容量復(fù)蘇后再灌注損傷的發(fā)生［8，9］，本研究沒(méi)有設(shè)立模型對(duì)照組，而是選用林格液復(fù)蘇組加以比較。

Tab 2 Effect of HES130/0.4 resuscitation on the expressionsof CD11 and CD18±s，n=6)

Tab 2 Effect of HES130/0.4 resuscitation on the expressionsof CD11 and CD18±s，n=6)

*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs RS group;△P<0.05 vs H1 group

Indicator Group T0 T1 T4 T5 CD11b Sham 30.2±1.5 32.8±2.0 33.8±1.3 30.2±1.6 RS 29.7±1.3 40.7±1.8* 80.8±2.6* 71.9±2.0*H1 30.5±1.4 38.5±1.9*#56.6±2.0*# 43.6±1.9*#H2 32.4±1.5 40.6±1.7*#68.2±1.6*#△ 65.0±1.7*#△CD18 Sham 50.6±1.9 49.6±2.0 51.6±1.8 51.4±2.0 RS 48.8±1.7 62.0±1.9* 92.8±3.5* 88.4±3.9*H1 51.1±2.0 63.2±2.0* 65.3±1.9*# 65.4±2.1*#H2 49.8±1.8 59.6±1.9* 77.9±1.8*#△ 79.4±2.8*#△

實(shí)驗(yàn)組給予不同劑量的HES130/0.4后，肺組織氧合功能指標(biāo)和超微結(jié)構(gòu)有不同程度的改善，說(shuō)明HES130/0.4可有效抑制失血性休克后早期肺損傷，具有一定的保護(hù)作用。

PaO2是反映氧供和氧耗的重要指標(biāo)之一;失血性休克時(shí)，氧供不足，肺組織通過(guò)提高氧的攝取和利用，使氧耗增加。本研究中各液體復(fù)蘇組復(fù)蘇前PaO2均不同程度增高證實(shí)了失血性休克后肺功能的變化。PaO2、PaCO2可在一定程度上反映肺泡毛細(xì)血管膜損傷的程度。本研究中與其他兩個(gè)液體復(fù)蘇組相比，6%HES130/0.4 33 ml·kg－1復(fù)合一定量的林格液復(fù)蘇后，PaO2、PaCO2、BE恢復(fù)較快。

激活的中性粒細(xì)胞(PMN)與微血管內(nèi)皮細(xì)胞(MVEC)相互粘附是PMN發(fā)揮作用的始動(dòng)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)［10］。粘附分子介導(dǎo)PMN游走、浸潤(rùn);整合素家族的MAC-1(CDllb/CD18)是粘附分子之一，在PMN與MVEC的緊密黏附過(guò)程中起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，失血性休克后林格液復(fù)蘇可導(dǎo)致大鼠肺組織CD11b和CD18的表達(dá)明顯增強(qiáng);用不同劑量的HES130/0.4復(fù)蘇后CD11b和CD18的表達(dá)降低，但這種作用在6%HES130/0.4 33 ml·kg－1復(fù)合一定量的林格液復(fù)蘇時(shí)最為明顯，表明6%HES130/0.4的抗炎作用與抑制CDllb/CD18這一整合素家族的表達(dá)或活性有關(guān)，有關(guān)研究也支持了這一論點(diǎn)［11，12］;但本研究中 6%HES130/0.4復(fù)蘇失血性休克早期，隨著劑量的增加其抗炎作用并沒(méi)有相應(yīng)增強(qiáng)，具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，6%HES130/0.4 33 ml·kg－1復(fù)合一定量的林格液復(fù)蘇可減輕失血性休克大鼠早期肺炎性損傷，其機(jī)制與抑制CDllb/CD18的表達(dá)有關(guān)。

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