類肝素酶、VEGF-C、D2-40在甲狀腺癌中的表達(dá)及臨床意義

田亮 桑偉 商曉青 李淑敏 蔣金芳 郭長軍 李鋒 趙瑾

新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室， 新疆 石河子 832000

甲狀腺癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤，甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma， PTC）是其最常見的病理類型，且以淋巴道轉(zhuǎn)移為主。長期以來人們研究的重點(diǎn)多集中于血管的形成與甲狀腺癌生長及轉(zhuǎn)移的關(guān)系上，甲狀腺癌淋巴管形成機(jī)制及其與腫瘤擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚未闡明。近年來，VEGF-C/VEGFR-3信號(hào)軸可以促發(fā)腫瘤淋巴管的生成已被很多學(xué)者所認(rèn)可，最近研究發(fā)現(xiàn)類肝素酶（heparanase，HPSE）可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞釋放VEGF-C，從而激活淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞生長通路，進(jìn)而促發(fā)淋巴管的生成。D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記淋巴管的特異性標(biāo)記物，用以估算淋巴管密度（lymphatic vessel density，LVD）。本研究應(yīng)用免疫組化SP法檢測HPSE、VEGF-C和D2-40在甲狀腺良惡性病變組織中的表達(dá)，探討其相互關(guān)系及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源 收集石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院和烏魯木齊軍區(qū)總院病理科存檔蠟塊，所有蠟塊均有較完整的臨床資料。其中甲狀腺癌77例（男性26例，女性51例），年齡19～72歲（平均年齡44.1歲）。甲狀腺良性組織32例：其中甲狀腺腺瘤17例（男性7例，女性10例），年齡22～69（平均年齡43.8歲），結(jié)節(jié)性甲狀腺腫15例（男性4例，女性11例），年齡15～76歲（平均年齡48.4歲）。以上病例均經(jīng)HE切片并經(jīng)兩位教授病理確診，外院標(biāo)本使用已獲得批準(zhǔn)。

1.2 分類標(biāo)準(zhǔn) 按2004年WHO病理組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)：甲狀腺乳頭癌51例，甲狀腺濾泡癌（follicular thyroid carcinoma，F(xiàn)TC）16例，甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）10例，腺瘤（adenoma）17例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫（nodular goiter）15例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。臨床分期按UICC頒布的甲狀腺癌分期標(biāo)準(zhǔn)，分為Ⅰ～Ⅳ期。

1.3 方法 所有標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)組織處理，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)HE染色。采用免疫組織化學(xué)SP法，具體操作步驟按試劑盒說明書上操作，以PBS液代替一抗作為陰性對照。兔抗人VEGF-C多克隆抗體和鼠抗人D2-40（淋巴管內(nèi)皮）單克隆抗體均購于北京中杉金橋生物有限公司，兔抗人HPSE（H-80）多克隆抗體購于Santa Cruz公司。工作濃度分別為1∶100、1∶100和1∶200。S-P試劑盒購于福州邁新生物公司。

1.4 評定標(biāo)準(zhǔn) HPSE 和VEGF-C免疫組化結(jié)果判斷：染色陽性為胞質(zhì)呈清晰棕黃色顆粒，當(dāng)陽性胞質(zhì)染色的細(xì)胞≤5%時(shí)，定為“-”，＞5%～25%為“+”，＞25%～50%為“++”，＞50%為“+++”。另外，規(guī)定“-”與“+”為低表達(dá)，“++”與“+++”為高表達(dá)。D2-40（LVD）結(jié)果判定：參考邢光明等［1］的標(biāo)準(zhǔn)：任何被染成棕紅色孤立的內(nèi)皮細(xì)胞、條索狀、裂隙狀、管狀細(xì)胞團(tuán)，只要能與鄰近的腫瘤細(xì)胞或其他結(jié)締組織分開，就視為一個(gè)淋巴管。計(jì)數(shù)參考Weidner［2］的標(biāo)準(zhǔn)：先在低倍鏡（×40）下觀察腫瘤周邊區(qū)、腫瘤中心區(qū)及相應(yīng)遠(yuǎn)端切緣正常組織，選擇其中淋巴管高密度區(qū)（hot spots），然后在高倍鏡（×200）下計(jì)數(shù)被染色的淋巴管數(shù)目。每個(gè)染成棕色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，只要與鄰近脈管、腫瘤細(xì)胞或其他結(jié)締組織分開，即視為一個(gè)淋巴管。計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野下的淋巴管數(shù)目，取其平均值作為該例的LVD。

2 結(jié) 果

2.1 HPSE、VEGF-C和D2-40在甲狀腺癌組織中的表達(dá) HPSE和VEGF-C均在甲狀腺癌組織中的胞質(zhì)中呈陽性表達(dá)（圖1A-B），正常濾泡上皮細(xì)胞及間質(zhì)成分也偶爾呈弱表達(dá)。由表1可見，77例甲狀腺癌組織中36例HPSE呈高表達(dá)（46.8%），VEGF-C有45例呈高表達(dá)（58.4%）。D2-40主要標(biāo)記位于腫瘤外周的淋巴管上皮，陽性部位為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)（圖1G），而腫瘤間質(zhì)內(nèi)的淋巴管很少表達(dá)。有時(shí)，在標(biāo)記的淋巴管內(nèi)可見侵入的癌細(xì)胞。

2.2 HPSE表達(dá)與VEGF-C、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及LVD的關(guān)系 HPSE與VEGF-C在甲狀腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.001，r=0.616， Spearman’s系數(shù)相關(guān)分析）。在表1中列出了HPSE與VEGF-C表達(dá)之間的關(guān)系及臨床病理參數(shù)，HPSE和VEGF-C在甲狀腺癌組織中呈高表達(dá)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（LNM）組陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P值分別為0.014和0.048，χ2檢驗(yàn)）（圖1A-D）。LVD在HPSE高表達(dá)的病例中往往比低表達(dá)的要顯著增高（P=0.005，秩和檢驗(yàn)）。VEGF-C表達(dá)與LVD也是相似關(guān)系（P=0.002，秩和檢驗(yàn)）。另外，甲狀腺癌中的高臨床分期（Ⅲ/Ⅳ）HPSE和VEGF-C的表達(dá)顯著高于低臨床分期（Ⅰ/Ⅱ）（表1）。HPSE和VEGF-C的表達(dá)與患者的年齡、性別等指標(biāo)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)一些患者雖臨床病理未確診轉(zhuǎn)移，但其HPSE、VEGF-C及LVD表達(dá)也有增高。

2.3 HPSE、VEGF-C及D2-40在甲狀腺腺瘤和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的表達(dá)情況 在良性對照組，HPSE和VEGF-C在甲狀腺腺瘤和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫均低表達(dá)（圖1E、F、H、I）（表1），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩者表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05 ）。另外，在腺瘤和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中的LVD明顯降低（表2）。兩者與各類型甲狀腺癌比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 HPSE和VEGF-C表達(dá)在各臨床病理參數(shù)相關(guān)性比較Tab.1 Correlation of clinicopathologic parameters with HPSE and VEGF-C expressions

表2 D2-40在甲狀腺癌、腺瘤及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中的表達(dá)Tab.2 Expression of D2-40 in thyroid carcinoma, adenoma and nodular goiter

圖1 HPSE、VEGF-C、D2-40在甲狀腺癌、腺瘤、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中的免疫標(biāo)記圖像Fig.1 Immunohistochemical staining image of HPSE, VEGF-C and D2-40 in thyroid carcinoma, adenoma and nodular goiter(SP)

3 討 論

淋巴道轉(zhuǎn)移是甲狀腺癌最常見的轉(zhuǎn)移方式，尤以乳頭狀癌為甚。近年來研究顯示，淋巴道轉(zhuǎn)移與淋巴管生成密切相關(guān)，隨著淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)研究的進(jìn)展及淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物的出現(xiàn)，淋巴管生成因子的研究取得了顯著進(jìn)展。VEGF-C是最先發(fā)現(xiàn)的淋巴管生成因子，其廣泛存在于具有侵襲性的組織細(xì)胞中。VEGFR-3（即FIt-4）是VEGF-C的特異性受體，屬于酪氨酸激酶受體， VEGF-C與VEGFR-3結(jié)合后，可誘導(dǎo)VEGFR-3酪氨酸激酶磷酸化，引起淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生，從而使淋巴管增生或擴(kuò)張。同時(shí)還可激活Ras/有絲分裂激活的蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或人組織激肽釋放酶通路，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生［3］。當(dāng)前，VEGF-C/VEGFR-3淋巴管生成途徑的研究多且深入，然而，學(xué)者們對是哪些物質(zhì)促發(fā)腫瘤細(xì)胞分泌淋巴管生成因子卻了解很少［4］。最近研究［5］表明HPSE與VEGF-C蛋白表達(dá)在頭頸部腫瘤細(xì)胞呈明顯正相關(guān)，尤其在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤。HPSE是β-1,4葡萄糖苷內(nèi)切酶，特異性地作用于硫酸肝素（heparinsullate，HS）并將其降解。HS側(cè)鏈作為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）和血管基底膜（basement membrane，BM）的主要成分，因而肝素酶對HS的降解破壞了ECM和BM的完整性［6-7］。在對于HPSE與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究中，人們以前對于HPSE的研究主要集中在降解ECM蛋白成分和促進(jìn)血管新生上。最近，Cohen-Kaplan等［5］研究得出HPSE可以促發(fā)腫瘤細(xì)胞釋放VEGF-C，從而促發(fā)淋巴生成。LVD與頭頸部腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，且HPSE表達(dá)與LVD及VEGF-C水平正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示HPSE和VEGF-C在甲狀腺癌組織中呈高表達(dá)，尤以乳頭狀癌表達(dá)為甚（P＜0.05），這與乳頭狀癌以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為主，而濾泡癌和髓樣癌主要以血道轉(zhuǎn)移理論相一致。兩者在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P值分別為0.014與0.048），并且HPSE與VEGF-C在甲狀腺癌組織中的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.001），其結(jié)果與Cohen-Kaplan等［5］報(bào)道相一致。另外，甲狀腺癌中的高臨床分期（Ⅲ/Ⅳ）HPSE和VEGF-C的表達(dá)顯著高于低臨床分期（Ⅰ/Ⅱ）。

由于淋巴管特異性標(biāo)記物的缺乏，腫瘤淋巴管生成的研究落后于血管生成的研究。D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的一種單克隆抗體，可識(shí)別一種相對分子質(zhì)量為40×103的O-連接唾液酸糖蛋白，而該糖蛋白特異性地表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮，而不表達(dá)于血管內(nèi)皮，其可以有效地評估甲醛和石蠟包埋的組織樣本的淋巴管新生［8］。本研究采用免疫組織化學(xué)對同一張切片分別用血管特異性標(biāo)記物CD34和D2-40進(jìn)行對照試驗(yàn)，對相應(yīng)結(jié)果進(jìn)行認(rèn)真比對，發(fā)現(xiàn)D2-40在CD34標(biāo)記的管樣結(jié)構(gòu)中呈陰性表達(dá)，從而進(jìn)一步證實(shí)了D2-40在甲狀腺組織中標(biāo)記淋巴管的特異性。本研究還發(fā)現(xiàn)，在HPSE表達(dá)高的病例中往往LVD也顯著增高，VEGF-C表達(dá)與LVD也是相似關(guān)系。D2-40主要標(biāo)記位于腫瘤外周的淋巴管上皮，而位于腫瘤間的小淋巴管很少表達(dá)。本研究結(jié)果與Yu等［3］結(jié)果相一致。

綜上所述，本研究表明HPSE與VEGF-C在甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮了重要作用， HPSE或許是VEGF-C淋巴管新生的上游誘導(dǎo)物，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。由于HPSE、VEGF-C與LVD在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌組織中表達(dá)增高，另外還發(fā)現(xiàn)一些患者雖臨床病理未確診頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但其HPSE、VEGF-C及LVD表達(dá)也增高，說明這些患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛在可能。因而，三者有望成為有效評估頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨床病理分子指標(biāo)。另外，檢測腫瘤患者中三者的表達(dá)對于手術(shù)范圍的選擇具有重要參考價(jià)值，它可以指導(dǎo)確定手術(shù)切緣，防止過度治療，從而提高患者的生活質(zhì)量。

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