四取代羧基酞菁鋅與白蛋白共價結合物的制備與光譜性質

肖榮平 柯美榮 黃劍東 張漢輝

(福州大學化學化工學院,福州 350108)

四取代羧基酞菁鋅與白蛋白共價結合物的制備與光譜性質

肖榮平 柯美榮 黃劍東*張漢輝*

(福州大學化學化工學院,福州 350108)

通過成酰胺鍵的方式制備了一系列含羧基酞菁和白蛋白(牛血清白蛋白(BSA),人血清白蛋白(HSA))之間的共價結合物,所涉及到的酞菁分別是α-四(4-羧基苯氧基)酞菁鋅(1)和α-四[4-(2-羧基乙基)苯氧基]酞菁鋅(3),以及它們相應的β位四取代酞菁鋅(化合物2和4).比較了游離酞菁以及它們的白蛋白結合物在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中的光譜性質.結果表明,當酞菁被共價固定于白蛋白大分子上之后,展現(xiàn)出比游離酞菁更明顯的單體特征吸收,而且結合物中的酞菁光譜特征不受體系pH值變化的影響.羧基在酞菁環(huán)上的取代位置,對酞菁與白蛋白結合前后的光譜轉變幅度有影響,α位取代比β位取代更有利于光譜的變化.化合物1和3的白蛋白共價結合物在PBS溶液中甚至呈現(xiàn)出單體形式為主的光譜特征,Q帶最大吸收波長分別位于697和706 nm附近.

酞菁;白蛋白;共價結合;光譜性質;光敏劑

光動力治療(photodynamic therapy,簡稱PDT)有望發(fā)展成為治療腫瘤的一種常規(guī)方法.光動力治療的關鍵之一是光敏劑,臨床上使用的第一代光敏劑主要是以Photofrin?為代表的血卟啉衍生物,但它們存在著有效成分復雜,皮膚光毒副作用大等嚴重缺陷,因此尋找新型光敏劑的研究工作備受重視[1-2].

由于具有在光療窗口吸收強度高、光敏化能力強、暗毒性低和易于化學修飾等特點,酞菁衍生物作為第二代光敏劑的研究已引起廣泛的重視[3-6].現(xiàn)在已有幾種酞菁基光敏劑獲準進入臨床試用,包括福州大學研制的ZnPcS2P2(即Photocyanine)[7].深入研究酞菁基光敏劑的構效關系和作用機理,尋找提高靶組織選擇性的有效方法,是當前該領域的研究熱點.最近我們課題組[8]合成了幾種具有光敏活性的含羧基酞菁鋅,并研究了取代基類型和取代位置對離子光動力抗癌活性的影響.在此基礎上,本文利用含羧基酞菁的活性基團羧基,通過成酰胺鍵的方式制備了一系列高水溶性的、未見報道的酞菁-白蛋白共價結合物,并著重研究了結合物的光譜性質,希望能對構建具有靶向功能的酞菁類光敏劑提供有益啟示.白蛋白是一種水溶性的運載蛋白,已有研究表明其可提高抗癌藥對某些癌細胞的靶向性[9-11].關于酞菁-白蛋白的復合物已有文獻報道[10-16],但大都是通過非共價鍵的方式結合,對于通過共價鍵結合的酞菁-白蛋白結合物的研究還極少,共價結合物的光譜性質、光動力活性和構效關系仍有待進一步揭示.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

T6紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;FL900/FS920型穩(wěn)態(tài)和瞬態(tài)熒光光譜儀,英國Edinburgh分析儀器公司;Spectrum 2000型傅里葉變換紅外光譜儀(采用KBr壓片法),美國Pekin Elmer公司;冷凍離心機,Thermo Scientific公司;PB-20 pH計,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司.

N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC),96%(w),中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司產品;N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),98%(w),Alfa Aesar公司產品;牛血清白蛋白(BSA)系中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司產品,人血清白蛋白(HSA)為美國Sigma公司產品,純度均為生物化學試劑級;葡聚糖凝膠Sephadex G-100,美國Sigma公司產品;考馬斯亮藍G-250,美國Fluka公司產品;透析袋,分子量為8000-12000,北京沃德塞斯生物公司產品;所用其它溶劑為中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司分析純產品.

本文所涉及到的四種含羧基酞菁分別為α-四(4-羧基苯氧基)酞菁鋅(記為1)、β-四(4-羧基苯氧基)酞菁鋅(記為2)、α-四[4-(2-羧基乙基)苯氧基]酞菁鋅(記為3)、β-四[4-(2-羧基乙基)苯氧基]酞菁鋅(記為4).這四種酞菁均為本實驗室所合成[8],其結構如圖1所示,化合物1、3是α位四取代化合物,而2、4是對應的β位四取代物.

1.2 酞菁-白蛋白共價結合物的制備

稱取α-四(4-羧基苯氧基)酞菁鋅(化合物1)6.9 mg和N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)7.9 mg溶于800 μL的二甲基甲酰胺(DMF)中避光攪拌2 h后,加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)3.5 mg,繼續(xù)避光攪拌反應4 h,得到羧基酞菁的N-琥珀酰亞胺酯衍生物.

稱取牛血清白蛋白(BSA)40.2 mg溶于4000 μL的PBS緩沖液(pH 7.4)中,在冰水浴中充分攪拌使之溶解.然后,將上述得到的羧基酞菁的N-琥珀酰亞胺酯衍生物緩慢地滴加到BSA溶液中,在冰水浴中不斷地攪拌,避光反應過夜.

6℃下離心除去不溶的沉淀物,移取上層溶液過凝膠柱(Sephadex G-100,柱長21 cm,柱內徑1.8 cm),用PBS緩沖溶液洗脫分離,收集前面的藍色洗脫液,冷藏待用.將收集液裝入透析袋中,用去離子水在4℃下透析兩天,期間每12 h換水一次,之后冷凍干燥,-20℃保存.

圖1 酞菁的結構示意圖Fig.1 Scheme for structures of phthalocyanines

示意圖1 酞菁-白蛋白結合物的合成Scheme 1 Synthesis of the albumin conjugate of phthalocyanine(Pc)

其它酞菁-白蛋白共價結合物按上述方法制得.

1.3 酞菁-白蛋白共價結合物的摩爾組成比的測定

結合物中白蛋白的含量用考馬斯亮藍法(簡稱CBB法)測定[17].酞菁配合物的含量則通過電子吸收光譜法測定:將結合物稀釋到DMF溶液中,通過Q帶的吸光度來計算酞菁含量.相應酞菁1的摩爾吸光系數(shù)為1.79×105mol-1·L·cm-1(686 nm),2為1.94× 105mol-1·L·cm-1(674 nm),3為2.05×105mol-1·L·cm-1(695 nm),4為1.82×105mol-1·L·cm-1(679 nm)[8].

1.4 電子吸收光譜

25℃下,以PBS緩沖溶液(pH 7.4)為參比,用稀釋法配制相應濃度的溶液,記錄300-800 nm的電子吸收光譜.

2 結果與討論

2.1 制 備

圖1所示的四種酞菁均含有羧基,因此可以利用該活性基團和白蛋白上的自由氨基通過成酰胺鍵的方式來制備酞菁-白蛋白的共價結合物.合成路線如示意圖1所示,首先,通過DCC將酞菁的羧基活化,而后,通過NHS將其進一步轉化為琥珀酰亞胺酯衍生物,轉化后的中間體是活性物質可以在溫和條件下與氨基成酰胺鍵,該合成路線經常用于制備含羧基的有機分子與含氨基的蛋白質的共價偶聯(lián)物[18-19].

根據(jù)反應原理,反應產物中應包括酞菁-白蛋白結合物和游離酞菁.由于在本實驗中,酞菁和白蛋白的投料摩爾比為10∶1(即酞菁充分過量),因此反應產物中應不含游離蛋白或游離蛋白的含量極少.

利用凝膠色譜對目標產物進行分離純化,并通過測量洗脫組分在相應酞菁Q帶最大吸收波長處的吸光度和340 nm處的熒光強度(此為白蛋白的內源熒光,用280 nm光激發(fā))來監(jiān)控分離過程.圖2顯示了其中一個結合物(1-BSA)的分離洗脫曲線,10-20 mL對應的洗脫組分既有697 nm的酞菁吸收又有340 nm的白蛋白熒光,且分子量最大,應為酞菁-白蛋白共價結合物,而35-43 mL的洗脫組分只顯示有697 nm的吸收而未有340 nm的熒光,應為游離的酞菁1.

對于分離純化后的結合物,通過電子吸收光譜法和考馬斯亮藍法測定酞菁和白蛋白的含量,求得結合物中二者的摩爾組成比,結果列于表1.從中可見,當酞菁/白蛋白投料摩爾比相同(均為10∶1)時,四種酞菁與兩種白蛋白之間形成的共價結合物的組成比基本上是相當?shù)?大約為(6-7)∶1(酞菁/白蛋白),說明本文中羧基苯氧基與羧基乙基苯氧基的區(qū)別以及官能團在酞菁環(huán)上的位置差異(α位取代和β位取代)對白蛋白負載羧基酞菁的能力沒有顯著影響,也說明兩種白蛋白BSA和HSA之間的差異對共價結合物的組成比沒有顯著影響.

本文獲得的共價結合物的摩爾組成比為(6-7)∶1,即每分子白蛋白負載6-7個酞菁分子,假設每個酞菁的4個羧基全部與白蛋白共價結合,那么白蛋白需要提供24-28個自由氨基,這在理論上是允許的, HSA含有59個賴氨酸殘基[20],即可提供59個自由氨基,而BSA則可提供61個自由氨基[21].共價結合物的形成,也可從紅外光譜中得到印證:游離酞菁在1695 cm-1處出現(xiàn)可歸屬于羧基中的羰基伸縮振動的特征吸收峰,而在酞菁-白蛋白共價結合物的紅外光譜中,1695 cm-1處的吸收峰強度大幅下降,但在1653 cm-1處出現(xiàn)可歸屬于酰胺鍵的羰基伸縮振動的強吸收峰.

圖21 -BSA結合物的洗脫曲線Fig.2 Elutionprofilesof1-BSAconjugateasmonitoredabsorbance at 697 nm and fluorescence emission at 340 nm upon excitation at 280 nm

表1 酞菁-白蛋白結合物的摩爾組成比Table 1 Molar ratio of phthalocyanine to albumin in the phthalocyanine-albumin conjugates

2.2 電子吸收光譜與存在狀態(tài)

電子吸收光譜是抗癌光敏劑產生光動力治療效應的基礎之一.因此,本文著重比較了所制備的酞菁-白蛋白結合物和游離酞菁在模擬生理溶液PBS中的電子吸收光譜,結果列于圖3-5和表2.

圖3是化合物1在DMF、40%DMF水溶液(體積比)和PBS溶液(pH 7.4)中的電子吸收光譜.從中可見,化合物1在DMF中顯示了典型的酞菁單體吸收光譜性質,尖銳且強的Q帶最大吸收波長位于686 nm附近,說明化合物1在DMF中以單體形式存在.而在40%DMF水溶液和PBS溶液中,化合物1的吸收光譜發(fā)生了明顯變化:686 nm附近的吸收顯著下降,650 nm附近的吸收則明顯上升,而且這樣的光譜變化趨勢隨著體系水含量的增加而加劇.這說明1在含水溶液中形成面對面聚集體[22-23],聚集體的特征吸收峰相對于單體藍移,位于650 nm附近.

圖3 化合物1在DMF(a)、40%DMF/H2O(體積比)(b)和PBS(c)溶液中的電子吸收光譜Fig.3 Electronic absorption spectra of compound 1 in DMF(a),40%DMF/H2O(V/V)(b),and PBS(c) [1]=4 μmol·L-1

在水溶液中形成分子間聚集體,是酞菁這類具有大π鍵共軛體系物質的普遍特點.聚集體的形成提供了光敏劑激發(fā)態(tài)的一個非輻射能量衰減的有效途徑,縮短了光敏劑激發(fā)態(tài)的壽命,大幅降低了光敏劑的光敏化能力[24-26].如何避免光敏劑在生理溶液中形成聚集體,一直是該領域的一個重要問題.

化合物2在PBS中的電子吸收光譜如圖4所示,從圖中可見,其在PBS中亦存在面對面聚集體,聚集體吸收峰位于637 nm附近,而單體吸收峰位于668 nm附近.化合物3和4在PBS中的電子吸收光譜性質分別與化合物1和2相似.四個化合物在PBS中均存在單體-聚集體平衡,聚集的程度有所不同.從單體和聚集體特征吸收強度之比Amonomer/ Aaggregate的大小,可以分析體系中單體與聚集體的相對比例,Amonomer/Aaggregate的值越小,說明聚集程度越大.從表2可知,β位四取代的2和4的Amonomer/Aaggregate分別小于對應的α位四取代物1和3,說明β位取代酞菁化合物在水溶液中更易形成聚集體.這從它們在PBS溶液中的光譜形態(tài)也可看出:化合物2和4的聚集體峰的吸收強度大于單體峰的吸收強度,而化合物1和3的情況則剛好相反.換言之,取代基位于α位,較之位于β位,更容易阻止酞菁在模擬生理溶液中形成聚集體.

圖4 化合物2(a),2-BSA(b)和2-HSA(c)在PBS溶液中的電子吸收光譜Fig.4 Electronic absorption spectra of compound 2 (a),2-BSA(b),and 2-HSA in PBS(c) [2]=6 μmol·L-1

圖5 化合物1(a)、1-BSA(b)和1-HSA(c)在PBS溶液中的電子吸收光譜Fig.5 Electronic absorption spectra of compound 1 (a),1-BSA(b),and 1-HSA(c)in PBS [1]=6 μmol·L-1

圖5比較了1-BSA和化合物1在PBS溶液中的電子吸收光譜,從中可見,前者在650 nm附近的聚集體吸收峰下降,而在690 nm附近的單體吸收峰明顯增強,Amonomer/Aaggregate為2.18,明顯大于游離酞菁1的相應值(1.22,見表2).1-HSA的情況與1-BSA相似.這說明共價鍵合在白蛋白上的酞菁,相比于游離酞菁,在模擬生理溶液中更不易發(fā)生聚集現(xiàn)象.不僅如此,1-BSA(或1-HSA)在PBS溶液中的酞菁單體吸收峰還呈現(xiàn)出較強且相對尖銳的特點,說明1-BSA(或1-HSA)中的酞菁1主要以單體形式存在.

化合物3和化合物1均為α位四取代酞菁配合物,兩者與白蛋白的共價結合物具有類似的電子吸收光譜特征,3-BSA和3-HSA在PBS溶液中亦表現(xiàn)出酞菁以單體形式為主的電子吸收光譜特征(見表2).這些實驗結果可為解決酞菁光敏劑在生理溶液的聚集問題提供有益的啟示.

表2 酞菁-白蛋白結合物在PBS溶液中的電子吸收光譜數(shù)據(jù)Table 2 Electronic absorption spectroscopic data of Pc-albumin conjugates in PBS

化合物2、4是β位四取代酞菁配合物,分別是α位四取代物1、3的位置異構體,它們與白蛋白的結合物也顯示了酞菁的存在狀態(tài)由聚集體向單體轉化的趨勢,但是轉化程度較相應的α位取代物小(見圖4和表2).尤其是4-BSA和4-HSA,在PBS溶液中仍然顯示出酞菁以聚集體為主要存在形式的電子吸收光譜特征(即Amonomer/Aaggregate小于1).

造成這些差異的原因可能是:羧基酞菁鋅通過形成酰胺鍵與白蛋白共價結合后,酞菁被固定在蛋白肽鏈中的不同位置的自由氨基上,只能在此氨基附近的狹小空間活動,有效地阻止了酞菁環(huán)之間的π-π堆積,因此酞菁-蛋白共價結合物中的酞菁比未與蛋白共價結合的游離酞菁的單體程度都要明顯提高.而酞菁上的β位取代基比相應α位取代基具有更為伸展的空間排列,當形成酞菁-蛋白共價結合物后,β位取代的羧基酞菁比α位取代的羧基酞菁更有機會與鄰近的酞菁產生π-π相互作用,從而增大了形成聚集體的趨勢.

2.3 pH值的影響

本文還進一步考察了體系pH值對酞菁及其白蛋白結合物的電子吸收光譜性質和存在狀態(tài)的影響.

圖6 化合物1在pH值為2.0(a),7.4(b)和12.0(c)的PBS溶液中的電子吸收光譜Fig.6 Electronicabsorptionspectraof1inPBSwith pH=2.0(a),pH=7.4,(b)andpH=12.0(c) [1]=6μmol·L-1)

圖6為化合物1在pH值為2.0、7.4和12.0的磷酸鹽緩沖溶液中的電子吸收光譜.如圖6所示,對于α位四取代酞菁配合物1,在pH=2.0的磷酸鹽緩沖溶液中呈現(xiàn)出高度聚集的特征吸收(600-800 nm之間的吸收峰寬化)特性,隨著體系pH值的提高,發(fā)生較明顯的解聚作用(表現(xiàn)為酞菁單體的特征吸收峰相對尖銳而且吸收強度增強).這應該是由于羧基COOH在pH值較高的環(huán)境下脫質子化成為COO-,帶負電荷基團之間的排斥作用,促使了酞菁環(huán)之間的解聚.

圖7 結合物1-HSA在pH值為(a)2.0,(b)7.4和(c)12.0的PBS溶液中的電子吸收光譜Fig.7 Electronic absorption spectra of 1-HSA in PBS with(a)pH=2.0,(b)pH=7.4,and(c)pH=12.0 [1]=5 μmol·L-1

但是,當酞菁1通過共價結合的方式負載到白蛋白大分子上后,體系pH值的改變幾乎不影響其電子吸收光譜性質和存在狀態(tài)(見圖7),酞菁1仍然保留著以單體為主的存在狀態(tài).這說明共價結合物(1-HSA)的光譜性質在較大范圍內不受體系pH值的影響,是一個pH值不敏感體系.人體內有些組織的環(huán)境為酸性或堿性,如胃液具有較強的酸性,而腸道則呈現(xiàn)弱堿性,因此設計pH值適應范圍寬的光敏劑有實際意義.

本文中其它幾種酞菁與白蛋白的共價結合物也表現(xiàn)出相似的、不受pH值干擾的光譜性質.

游離的酞菁和酞菁-白蛋白共價結合物對體系pH值的不同響應,從一個側面也說明結合物中酞菁分子通過形成酰胺鍵固定在白蛋白大分子上了.

3 結 論

利用含羧基酞菁的羧基和白蛋白的氨基,通過成酰胺鍵的方式,制備了一系列高水溶性的、未見報道的酞菁-白蛋白共價結合物.結果表明:(1)四種含羧基的酞菁鋅在PBS溶液中存在單體-聚集體平衡,相對而言,α位取代的酞菁1和3,較β位取代的酞菁2和4,以更多的單體形式存在;(2)當酞菁小分子共價結合到白蛋白大分子上后,其在PBS溶液中展現(xiàn)出比相應游離酞菁更顯著的單體特征吸收,而且酞菁-白蛋白共價結合物的這種光譜特征不受環(huán)境酸堿度變化的影響.也即,羧基酞菁小分子通過成酰胺鍵的方式固定在白蛋白分子網格上后,其光譜特征受到一定程度的保護;(3)對于α位取代的酞菁1和3,其與白蛋白的共價結合物在PBS溶液中展現(xiàn)出以單體為主的電子吸收光譜特征,這是一個有利于產生光動力治療效應的性質,且這種有利的光譜性質不受pH值變化的影響,這對于設計pH值適應范圍寬、蛋白質靶向介導的高效光敏劑具有一定的啟發(fā)意義.進一步生物活性測試正在進行中.

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February 19,2010;Revised:April 8,2010;Published on Web:June 9,2010.

Preparation and Spectroscopic Properties of Covalent Albumin Conjugates of Zinc Phthalocyanines Tetrasubstituted with Carboxyl Moieties

XIAO Rong-Ping KE Mei-Rong HUANG Jian-Dong*ZHANG Han-Hui*
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Fuzhou University,Fuzhou 350108,P.R.China)

A series of covalently bound albumin(bovine serum albumin(BSA)and human serum albumin(HSA)) conjugates of phthalocyanines functionalized with carboxyls were prepared and resulted in amide bonds.The phthalocyanines are tetra-α-(4-carboxyl phenoxy)phthalocyanine zinc(1)and tetra-α-[4-(2-carboxyl-ethyl)phenoxy] phthalocyanine zinc(3)as well as their corresponding tetra-β-substituted counterparts(compounds 2 and 4).The spectroscopic properties of these phthalocyanines and their bioconjugates in phosphate buffer saline solution(PBS) were investigated.The phthalocyanines that are covalently bound to the albumins have a more obvious monomeric absorption characteristic than the corresponding free phthalocyanines.Moreover,the spectroscopic characteristics of the phthalocyanines in the bioconjugates are not affected by solution pH.The substitution position of the carboxyl moieties on the phthalocyanine ring has an effect on the spectroscopic transformation of these macromolecules after conjugation with the albumins.Substitution at the α-position of the phthalocyanine ring leads to more prominent spectroscopic changes than that at the β-position.Both 1-albumin and 3-albumin in PBS show monomeric phthalocyanine spectra with Q-band maxima at about 697 nm and 706 nm,respectively.

Phthalocyanine; Albumin;Covalent conjugate;Spectroscopic property;Photosensitizer

[Article] www.whxb.pku.edu.cn

*Corresponding authors.Email:jdhuang@fzu.edu.cn,hhzhang@fzu.edu.cn;Tel:+86-591-22866235.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20872016),Natural Science Foundation of Fujian Province,China (C0710033)and Program for New Century Excellent Talents in Fujian Province University,China(XSJRC2007-18).

國家自然科學基金(20872016)、福建省自然科學基金(C0710033)和福建省高等學校新世紀優(yōu)秀人才計劃(XSJRC2007-18)資助項目

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