蛋白質(zhì)質(zhì)譜在聲門上型喉鱗癌早期診斷中的研究

陳 濤，王榮旋，蔣科會

（遵義醫(yī)院，貴州 遵義 563002）

聲門上型喉癌早期癥狀不典型，僅有咽部異物感，感覺咽部食物吞咽不凈，癥狀輕微，容易誤診。大部分病人來就時已屬中晚期，預(yù)后較聲門型喉癌差，需行部分喉切除或喉全切除術(shù)，嚴重影響患者的生存質(zhì)量，因此聲門上型喉癌早期診斷顯得尤為重要。本研究擬應(yīng)用表面加強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)及其配套的蛋白質(zhì)芯片對聲門上型喉鱗癌患者和正常對照者血清中的蛋白質(zhì)組圖譜進行檢測，結(jié)合相關(guān)軟件建立決策分類樹診斷模型，提高早期診斷率。

1 臨床資料

1.1 臨床資料與標本來源 選擇2005年1月1日至2009年12月31日間，在遵義醫(yī)院住院首次治療的聲門上型喉鱗癌患者30例，其中男24例，女6例，年齡為42～78歲，中位年齡62歲，臨床病例資料完整，入院第二天晨起抽血，2小時內(nèi)提取血清無溶血者，血清提取后即入-80℃保存。對照組選用同期本院職工體檢健康者血清標本30例，作為正常對照組，年齡為40～83歲，中位年齡60歲。

1.2 實驗方法 血清標本收集：清晨空腹采取全血標本，常溫下放置2h，待自然凝固后，4℃1000 r/min離心30 min，取上層血清EP管分裝后立刻置血清標本庫-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

血清樣品預(yù)處理：取出-70℃保存血清，0℃冰浴中溶解，4℃10000 r/min離心2min，取5μl血清樣品，加入 8mmol/L 尿素 10μl，4℃振蕩 30min，吸取上清用于蛋白質(zhì)芯片檢測。

SELDI操作流程：在CM10蛋白質(zhì)芯片8個點（A-H點）的表面分別加10mM HCl 10uL，在濕盒內(nèi)放置10min后，吸去剩余的HCl，用去離子水洗芯片3次。將芯片安裝于生物處理器上。芯片A～H各點用200ul結(jié)合緩沖液（100mM NaAc乙酸鈉，pH4.0）預(yù)處理2次，每次室溫下振蕩孵育5分鐘。然后每點交叉滴加100ul已處理的聲門上型喉鱗癌或正常對照血清樣品，室溫振蕩孵育60min。棄掉表面樣品，各點用200 ul結(jié)合緩沖液洗滌3次，每次5min。最后各點再用1mM HEPES（pH 7.0）200ul迅速洗滌一次。卸去生物處理器，待芯片表面自然晾干后，各點加兩次0.5ul SPA，待芯片表面干燥后，用蛋白質(zhì)芯片閱讀機進行蛋白質(zhì)譜分析。

數(shù)據(jù)采集：采用PBSII-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀機讀取CM10芯片數(shù)據(jù)。每天使用前用Ciphergen公司提供的標準多肽和低于200kD的蛋白質(zhì)標準分子標化校正質(zhì)譜儀，系統(tǒng)質(zhì)量偏差為0.1%。檢測芯片時蛋白質(zhì)芯片閱讀機設(shè)置條件如下：激光能量200，檢測敏感度9，優(yōu)化分子量范圍1~70kD，每個樣品收集50個點，采用Ciphergen proteinchip分析軟件自動采集數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 因絕大多數(shù)檢測出的蛋白質(zhì)質(zhì)荷比 (mass-to-charge ratios,m/z)在1000～70,000范圍內(nèi)，故取該范圍為研究區(qū)間。利用Biomarker Wizard軟件對蛋白質(zhì)峰進行歸類分析，設(shè)定信噪比為5，不同組間相同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)峰值比較采用方差分析，統(tǒng)計分析由該軟件自動進行。兩個蛋白質(zhì)峰比較時，差異蛋白定義為蛋白質(zhì)峰值強度相差1倍以上。利用Biomarker Patterns Software對數(shù)據(jù)進行樹狀分組統(tǒng)計及相關(guān)性進行分析，建立分類樹模型。

2 結(jié)果

2.1 聲門上型喉鱗癌組和正常對照組血清蛋白指紋圖譜 絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)峰數(shù)量和強度在聲門上型喉鱗癌患者和正常對照者血清中基本相同，P≤0.05時，兩組間有9個差異性表達蛋白峰，其中3個在聲門上型喉鱗癌患者血清中高表達，m/z分別是9194.06，11681.15 和 51370.19，6 個低表達，m/z分別是 8815.96，13767.56，13884.95，14057.50，15879.20和17377.60。P≤0.01時有4個顯著差異性表達蛋白峰，其中3個在聲門上型喉鱗癌患者血清中高表達，m/z分別是 9194.06，11681.15 和 51370.19，1 個低表達，m/z是8815.96。兩組血清差異蛋白峰的峰值強度具體數(shù)值比較按P值排列見表1。

表1 聲門上型喉鱗癌組和正常對照組血清中差異蛋白峰的表達強度比較Table 1 Signal intensities of the differentially expressed proteins peaks in serum of supraglottic laryngeal squamous cell cancer and control group

根據(jù)軟件分析按照p值統(tǒng)計的結(jié)果m/z為11681的蛋白質(zhì)峰為候選差異峰，在聲門上型喉鱗癌中有高表達的趨勢，圖1和圖2為在11400~12000區(qū)段部分SELDI圖譜對比，圖3為11400~12000區(qū)段部分模擬電泳圖對比。

圖1 聲門上型喉鱗癌患者和健康對照血清11400~12000區(qū)段蛋白質(zhì)指紋圖譜比較Fig1 The spectral view of differently expressed protein peaks at the m/z value from 11400 to 12000 between supraglottic laryngeal squamous cell cancer patients and control group

圖2 聲門上型喉鱗癌患者和健康對照者血清11400~12000區(qū)段SELDI圖譜比較圖Fig 2 Differently expressed protein peaks at the M/Z value of 11681 between supraglottic laryngeal cancer patients and control group

2.2 聲門上型喉鱗癌決策分類樹診斷模型的建立將Biomarker Wizard軟件分析獲得有差別的蛋白質(zhì)峰建立數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入Biomarker Pattern統(tǒng)計分析軟件采用決策聚類樹分析法進行分析處理（靈敏度界定于0.05）。結(jié)果顯示沒有一個標志蛋白能單獨將聲門上型喉鱗癌患者和正常人完全分開。分析系統(tǒng)經(jīng)過篩選，m/z值分別為9194.06，15879.1，51370.1，6624.57，8929.80，1013.77 和 11681.1 的 蛋 白 峰 被Biomarker Pattern軟件自動選取用于建立樹狀決策分類模型，包括8個結(jié)點 (Node)和9個終結(jié)點(Terminal Node)。

圖3 聲門上型喉鱗癌患者和正常對照血清11400~12000區(qū)段SELDI蛋白質(zhì)強度的模擬電泳比較圖Fig 3 Com parison of SELDI gel-view profiles at the m/z value from 11400 to 12000 between supraglottic laryngeal squamous cell cancer patients and control group

應(yīng)用軟件計算聲門上型喉鱗癌和正常對照組各差異蛋白峰的權(quán)重，結(jié)果7個顯著差異性蛋白質(zhì)峰按變量重要性評分依次為：M9194_06(100)，M51370_1(98.6),M15879_1(69.06),M6624_57(66.91)，M8929_80(57.75),M11681_1(53.55),M1013_77(44.17)。

采用該分類樹建立起來的聲門上型喉鱗癌診斷模型，在學(xué)習(xí)模式下(learning)，在30例聲門上型喉鱗癌患者中有26例被樹狀分析模式正確篩出，靈敏度(sensitivity)為86.66%，30例正常人有27例完全被正確篩出，特異度(specificity)為90%。

3 討論

聲門上型喉鱗癌是惡性程度較高的一種腫瘤，早期癥狀隱匿，不易引起患者甚至非?？漆t(yī)生的注意，確診時多已晚期。盡管近年來無論是外科技術(shù)還是放療、化療、生物靶向治療等綜合治療措施均取得較大進展，但聲門上型喉鱗癌的治療效果仍不理想，生存率較低，嚴重威脅患者的生存和生活質(zhì)量[1~2]。因此有必要尋求一種有效的早期診斷方法，使疾病在發(fā)生的早期就可以發(fā)現(xiàn)，并得到控制和治療，進而提高治愈率，改善患者的預(yù)后。

差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以比較腫瘤和正常細胞之間的蛋白質(zhì)組異同，從而發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性蛋白找到腫瘤標志物。蛋白質(zhì)組技術(shù)的規(guī)?；攸c使得同時找出與腫瘤相關(guān)的多個蛋白或蛋白群成為可能，從而提高對疾病的認識。近年來，各種蛋白質(zhì)組研究技術(shù)在腫瘤的發(fā)病機制、早期診斷、分型、療效評價等方面獲得應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)了一系列腫瘤相關(guān)蛋白和潛在的腫瘤蛋白標志物，為腫瘤研究提供了豐富資源。SELDI技術(shù)是近幾年才發(fā)展起來的一種新的臨床蛋白組學(xué)方法，具有操作簡便、可直接分析原始生物樣本（如血清、尿液、胸腹水等）、樣本用量小等特點，同時適合多樣品平行檢測和直接進行蛋白質(zhì)全景式的搜索和分析，特別是對小分子量蛋白和低豐度蛋白具有較高的捕獲效果，可以與其他蛋白質(zhì)組學(xué)方法互補，有望成為一種前景廣闊的惡性腫瘤診斷新方法，該技術(shù)較高的特異性和敏感性在卵巢癌、前列腺癌、肝癌和肺癌等已有多篇報道[3~6]。

卵巢腫瘤在臨床上缺乏敏感特異的腫瘤標志物，美國FDA和NIH的臨床蛋白質(zhì)組研究小組的成員Petricoin等[7]用疏水性蛋白芯片對50例健康婦女、50例卵巢癌患者的血清蛋白進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康人相比，在質(zhì)荷比值為534、989、2111、2251和2465處的5峰同時發(fā)生變化，其中卵巢癌患者血清中2251波峰下降，其余均升高，對于診斷具有重要意義。應(yīng)用該模型對116例來自健康、早期和晚期卵巢癌以及良性疾病婦女的血清樣品進行盲法分析預(yù)測。結(jié)果50例卵巢癌的樣品被全部準確檢出，其中包括18例早期患者。66例非惡性腫瘤人群對照組中有63例確定為非惡性腫瘤。此結(jié)果表明，該方法的靈敏度為100%(95%CI93～100)，特異度為95%(87%～99%)，陽性預(yù)測值為 94%(84%～99%)。結(jié)果說明，運用SELDI-TOF-MS技術(shù)可以篩選出高效的蛋白標記，并可在臨床上用于卵巢癌的早期診斷。

Yang等[8]用SELDI-TOF-MS對158例肺癌患者和50例正常對照者的血清進行了分析。發(fā)現(xiàn)有18個蛋白質(zhì)峰異常表達。選取其中相對分子質(zhì)量為11493、6429、8245、5335 和 2538 的 5 個蛋白質(zhì)峰建立一個腫瘤標志物圖譜，經(jīng)盲法檢測后，發(fā)現(xiàn)其診斷肺癌的敏感度和特異度分別為86.9%和80%(非小細胞肺癌的敏感度達91.4%)，其陽性預(yù)測值為92.4%。其中，對于早期肺癌的敏感度為79.1%，遠遠超過了目前臨床使用的腫瘤標志物。

Zhukov等[9]聯(lián)合激光捕獲顯微切割和蛋白質(zhì)芯片SELDI-TOF-MS技術(shù)，對正常喉組織、非典型腺瘤樣增生和惡性腫瘤的冰凍切片進行激光捕獲顯微切割，獲得純的細胞數(shù)進行質(zhì)譜分析時發(fā)現(xiàn)，SELDI質(zhì)譜在探測喉腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)圖譜上具有高度重復(fù)性。(17~23)×103范圍內(nèi)的3個峰值在腫瘤細胞系中比正常細胞明顯增加，其中峰值17.25×103蛋白在任何一個正常的細胞樣本中均未被發(fā)現(xiàn)，而在非典型腺瘤樣增生組中呈低水平表達。

由于血清能反復(fù)獲得，且血液中包含眾多尚未知的生物標志物，因此本研究利用血清進行其蛋白質(zhì)的分析。細胞內(nèi)數(shù)以萬計的不同蛋白質(zhì)及其裂解或修飾形式是細胞生理或病理活動的反映，這些蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段隨著周圍的血液和淋巴液進入循環(huán)，因而在血清蛋白質(zhì)中，除高豐度或大分子的駐留蛋白如白蛋白、球蛋白和其它載體蛋白外，還有低豐度的小分子蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，而后者包含著大量的診斷信息[10]。

本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測了50例聲門上型喉鱗癌和50名正對照血清標本。發(fā)現(xiàn)兩組間有9個差異性表達蛋白峰，其中3個在聲門上型喉鱗癌患者血清中高表達，m/z分別是9194.06，11681.15和51370.19，6個在聲門上型喉鱗癌患者血清中低表達，m/z分別是8815.96,13767.56,13884.95,14057.50,15879.20和17377.60。應(yīng)用數(shù)據(jù)建立分類樹模型，獲得了一個由7個蛋白9194.06,51370.1,15879.1,6624.57,8929.80,11681.1,1013.77組成的標志蛋白組合模式。在訓(xùn)練組中，該模式的敏感性和特異性分別為86.66%和90%，是一種高敏感性、高特異性的聲門上型喉鱗癌診斷方法，有望成為臨床上從高危人群中快速方便篩查聲門上型喉鱗癌患者的診斷平臺。

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