HPLC法測定大黃相關(guān)制劑中大黃素的含量

荊 晶，陸小丹，周旭美

（遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義563003）

大黃為蓼科植物掌葉大黃（Rhrum palmatum L.）、唐古特大黃（Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.）或藥用大黃（Rheum officinale Baill.）的干燥根及根莖[1]。具有瀉下攻積、清熱瀉火、止血、解毒、活血化瘀之功效。大黃中的主要藥效成分為蒽醌類衍生物如大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃酸等[2]。清胰Ⅱ號是由大黃、梔子、赤芍、丹皮等中藥研制的復(fù)方制劑。具有清熱涼血、理氣開郁、活血止痛、通理攻下的作用，用于治療急性胰腺炎已有三十多年的臨床經(jīng)驗[3]。經(jīng)近上千多例急性胰腺炎，近上百例重癥急性胰腺炎（SPA）的治療、總結(jié)，收到較好的療效，SPA的治愈率顯著上升，達到國內(nèi)領(lǐng)先水平。

1 材料與方法

1.1 藥品試劑 大黃素對照品（含量測定用，批號∶110756－200110中國藥品生物制品檢定所），乙腈（色譜純，上海星可生化有限公司），乙醇（分析純，成都市科龍化工試劑廠），冰醋酸（分析純，成都市科龍化工試劑廠），甲醇（色譜純，上海星可生化有限公司），高純水。

1.2 儀器 美國Agilent 1100高效液相色譜儀，包括紫外檢測器和色譜工作站。Agilent Eclipse XDB C-18（150×4.6mm，0.46μm） 色譜柱。塞多利斯BT125D電子天平（北京塞多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB C-18（150×4.6mm，0.46μm）。以乙腈-0.1%冰醋酸溶液（50∶50）為流動相；檢測波長為254nm，流速1.0ml/min，柱溫為30℃，進樣量20μl[4]。

1.4 溶液制備

1.4.1 對照品溶液的制備 稱取大黃素標(biāo)準(zhǔn)品0.6mg，置于25ml的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至25ml，配成 0.024mg／ml的大黃素標(biāo)準(zhǔn)液，置于 4℃冰箱中保存。

1.4.2 清胰Ⅱ號供試品溶液的制備 按照清胰Ⅱ號的配方稱取原料[5]，將原料放在煎煮鍋里進行煎煮（大黃、芒硝除外）。煮前快速浸泡5min左右，放干水，次日加入適量的水煎煮20min后，將已浸洗的大黃放入鍋中，再酌加適量的水繼續(xù)煎煮10min，藥液放出過濾，藥渣加入適量的水繼續(xù)煎煮，每次30分鐘。藥液過濾合并。將藥液進行濃縮，用部分藥液將芒硝溶解，合并藥液，加入適量的苯甲酸鈉至藥液中，使至規(guī)定體積500 ml，使最后藥液中苯甲酸鈉的濃度為1.5%，攪拌均勻，備用。

1.4.3 清胰Ⅱ號對照品溶液的制備 不加入大黃，按照清胰Ⅱ號供試品溶液的制備方法操作，其他步驟均相同，制得大黃的陰性對照品溶液，備用。

2 含量測定

2.1 測定波長的選擇 根據(jù)2005年版《中國藥典》第一部附錄ⅤA的紫外可見分光光度法，掃描大黃素的最大吸收波長，掃描范圍200～600nm，大黃素的最大吸收波長為254nm，與大黃藥材含量測定項下的測定波長相一致，確定大黃素的測定波長為254nm。結(jié)果見圖1。

圖1 大黃素光譜掃描曲線Fig 1 UVscanning of Emodin

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 以乙腈-0.1%冰醋酸溶液（50∶50）為流動相；檢測波長為 254nm，流速 1.0ml/min，柱溫為30℃，進樣量20μl此條件下對照品、供試品在約12min時間均有一色譜峰，陰性對照品無干擾。見色譜圖2。

圖2 大黃素高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram s of Emodin

2.3 線性關(guān)系的考察 采用大黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液制得一系列梯度溶液，其濃度分別為1.2μg/ml、2.4μg/ml、4.8μg/ml、7.2μg/ml、9.6μg/ml、12.0μg/m l。按

2.2 色譜條件進樣20μl，測定大黃素對照品的峰面積，將濃度與峰面積進行線性回歸處理，得出回歸方程為：Y=72.638X+31.042，r=0.9999，大黃素對照品在1.2μg/m l～12.0μg/ml范圍內(nèi)樣品濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗 精密吸取大黃素對照品溶液（濃度為4.8μg/ml）20μl，按上述色譜條件，重復(fù)進樣6次，每次20μl，測定對照品中大黃素峰面積值，計算峰面積值的RSD為1.12%。說明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取大黃素供試品溶液20μl，按上述色譜條件，每隔兩小時，測定供試品溶液中大黃素峰面積值，計算供試品大黃素峰面積值的RSD為1.72%。說明供試品在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗 取清胰Ⅱ號水提法提取液，稱取10.00g，共6份，置于25ml容量瓶中，用甲醇定容并超聲30min[6]，按上述色譜條件進行測定，測定結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)處理，平均含量14.137μg/g，RSD為0.29%。

2.7 加樣回收率試驗 取本品(批號）共9份，每份重約5.00g，置于25ml容量瓶中，分別精密加入大黃素對照品溶液（7.2μg/ml）8ml、10ml、12ml。余下的量用甲醇補足，然后超聲30min，冷卻后，吸取20μl，測定峰面積計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果

2.8 大黃素含量測定 按照前文所述的方法和條件測試六批樣品，并計算其含量。結(jié)果如表2。

表2 大黃素含量測定

3 討論

本次實驗采用高效液相色譜法對大黃素相關(guān)制劑清胰Ⅱ號湯劑中大黃素進行含量測定，與其他方法相比，具有操作簡便，準(zhǔn)確性好，靈敏度高，重現(xiàn)性好的特點，在制訂大黃相關(guān)重要制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時，可以使用大黃素含量作為指標(biāo)。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典Ⅰ部［S］.化學(xué)工業(yè)出版社，2005.17.

[2]徐雄良,張志榮.超聲提取法測定熊膽消炎膠囊中大黃素和大黃酚的含量[J].華西藥學(xué)雜志,2003,18(6):442-444.

[3]賴良，王洋.清胰湯在重急性胰腺炎治療中的作用［J］.中國基層醫(yī)藥，2006，13（1）：95-96.

[4]Jun Cai，MD.Feassibility Evaluation of Emodin（Rhubarb Extract）as an Inhibitor of Pancreatic Cancer Cell Pancreatic In Vitro［J］.Original Communications,2008,32(2):190-196.

[5]楊驍軍.高效液相色譜法測定安神益腦丸中大黃素的含量［J］.海峽藥學(xué)，2009，21（7）：71-73.

[6]周卿.RP-HPLC同時測定清胰湯顆粒中梔子苷芍藥苷個含量［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，32（6）：269-270.