均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選銀杏葉總黃酮及其降糖作用的研究

胡旭濤

均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選銀杏葉總黃酮及其降糖作用的研究

胡旭濤

目的 研究超聲輔助提取銀杏葉總黃酮的最優(yōu)工藝及降糖作用。方法 采用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，STZ建立糖尿病大鼠模型，并進(jìn)行降糖研究。結(jié)果 最優(yōu)工藝參數(shù)為：超聲波強(qiáng)度2000w,固液比1：15，乙醇濃度50%，黃酮提取率為(2.59±0.06)%，且降糖作用顯著。結(jié)論 超聲輔助提取能夠?qū)崿F(xiàn)銀杏葉總黃酮的常溫快速提取,且降糖作用顯著。

銀杏；總黃酮；超聲輔助；均勻設(shè)計(jì)

現(xiàn)代藥理研究證實(shí)銀杏黃酮可抑制血糖的升高，可預(yù)防和治療糖尿病[1]，具有改善高脂喂養(yǎng)2型糖尿病大鼠胰島素抵抗和降低血脂的作用，銀杏葉黃酮可能成為治療2型糖尿病和高脂血癥的新藥。本實(shí)驗(yàn)研究了超聲輔助在銀杏葉總黃酮提取中應(yīng)用的可行性及其藥理作用，為進(jìn)一步研究銀杏葉總黃酮及其藥理作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 材料：廣惠和大藥房；化學(xué)試劑為分析純。儀器：JA2003型電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京紅葉科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超聲輔助銀杏葉總黃酮提取工藝 稱取干燥過40目的銀杏葉5g，石油醚浸泡24h,過濾，3000r／min離心10min，沉淀物各預(yù)設(shè)條件(超聲波強(qiáng)度、固液比、乙醇濃度)在水浴中進(jìn)行超聲輔助提取，提取3次，過濾，以3500r／min離心10min，得上清液，濃縮，再加入20倍體積的乙醇，超聲溶解，2℃冰箱中放置，過夜，3500r／min離心10min,氯仿萃取三次，濃縮冷凍干燥，備用。

1.2.2 含量測定 參照原愛紅[2]的測定方法采用蘆丁為對照品，蘆丁含量(y)與質(zhì)量濃度(X，mg／L)最小二乘法得回歸方程為Y=2.51X+2.17864，相關(guān)系數(shù)R=0.9997。

1.2.3 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)法 以影響有效成分提取率的固液比，乙醇濃度，超聲波強(qiáng)度為因素，各因素取3個(gè)水平，探求超聲輔助提取銀杏葉總黃酮的最佳工藝。用均勻設(shè)計(jì)3.0版軟件篩選出u9(33)表安排實(shí)驗(yàn)[3]，數(shù)據(jù)見表1。

1.2.4 動(dòng)物模型的建立及其處理 正常對照組：SD大鼠喂以普通飲食，其中碳水化合物60%，蛋白質(zhì)22%，脂肪10%，其他8%。糖尿病組和處理組：喂以高脂飲食，其中碳水化合物40%，蛋白質(zhì)13%，脂肪40%，其他7%，3個(gè)月后，一次性腹腔注射STZ25mg(kg.bw)，其他組均腹腔注射檸檬酸緩沖液，并繼續(xù)高脂喂養(yǎng)。72h后尾靜脈取血，分別測血糖及胰島素，凡血糖濃度＞13mmol/L，尿糖呈強(qiáng)陽性者，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿者為糖尿病模型，然后對照組和糖尿病組喂飼普通飼料，自由飲水外，每天以蒸餾水灌胃(2.5ml／d)。處理組每只大鼠給予銀杏葉黃酮60mg／kg分別灌胃，每天灌胃1次，共10周，末次給藥后禁食12h，乙醚麻醉，靜動(dòng)脈取血，分離血清，測定血糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)通過均勻設(shè)計(jì)3.0版軟件中自選變量法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用固液比A、乙醇濃度B、超聲波強(qiáng)度C對應(yīng)變量總黃酮提取率Y多元逐步回歸法進(jìn)行分析，回歸分析采用后退法,顯著性水平α＝0.05，得回歸方程Y=0.635X1+0.314X2+0.342X3，復(fù)相關(guān)系數(shù)：R=0.9998,檢驗(yàn)值Ft=12.27,臨界值F(0.05,3,3)＝8.277,Ft＞F(0.05,3,3), 回歸方程顯著，剩余標(biāo)準(zhǔn)差s＝0.127，回歸方程有意義,由回歸方程因素的系數(shù)可見固液比、乙醇濃度和超聲波強(qiáng)度量的影響均為正效應(yīng)，從標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，固液比＞超聲波強(qiáng)度＞乙醇濃度。再將方程在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行優(yōu)化處理，Y的期望值方向大者為佳。根據(jù)回歸方程得出最優(yōu)組合：A=15，B=50%，C=20，預(yù)測值Y=2.53%。從而得出總黃酮提取的最佳工藝為超聲波強(qiáng)度2000w,固液比1：15，乙醇濃度50%。

表1 U7(73)均勻試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果

2.2 驗(yàn)證方案 按照最優(yōu)工藝參數(shù)(超聲波強(qiáng)度2000w,固液比1：15，乙醇濃度50%進(jìn)行了3次平行試驗(yàn)，顯示提取率可穩(wěn)定為(2.59±0.06)%，與預(yù)測值相符，而且重復(fù)性也很好，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。

2.3 降糖作用的研究 模型組小鼠血糖值顯著高于正常組;糖尿病模型大鼠給予黃酮治療后小鼠的血糖與模型組相比,顯著降低。說明銀杏葉黃酮可降低糖尿病大鼠血糖。

3 討論

采用均勻設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，得到最優(yōu)工藝方案，試驗(yàn)次數(shù)大大減小。超聲輔助提取銀杏葉中總黃酮，需要超聲波強(qiáng)度2000w,固液比1:15，乙醇濃度50%，黃酮提取率為(2.59±0.06)%，時(shí)間短，收率高，操作簡單，能耗低，常溫提取使黃酮類化合物不會因熱效應(yīng)損失和降低活性節(jié)約資源。

本實(shí)驗(yàn)顯示,模型組血糖水平較正常組顯著升高, 糖尿病模型小鼠經(jīng)黃酮治療后, 其血糖水平顯著性降低。本實(shí)驗(yàn)中模型組血糖水平較正常組顯著升高,說明糖尿病小鼠存在一定的腎功能損害。糖尿病模型小鼠經(jīng)黃酮治療后,其血糖水平顯著性降低,說明黃酮對腎臟具有一定的保護(hù)作用，具有很好的應(yīng)用前景。

[1] 何曉靜,朱美玲,宋潔.銀杏葉總黃酮對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,41(3):283-285.

[2] 原愛紅,黃哲,馬駿.銀杏葉黃酮的提取及其降糖作用的研究[J].中草藥,2004,35(11):1242-1243.

[3] 宋晚平,張鞍靈,高錦明.化感植物向日葵根提取液的抑菌活性研究[J].西北植物學(xué)報(bào),2004,24(10):291-293.

[4] 陳濤,李進(jìn),褚治德.黃芪藥材的微波提取工藝研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2009,20(2):349-350.

10.3969/j.issn.1009-4393.2010.33.031

462300 漯河市郾城區(qū)人民醫(yī)院 (胡旭濤)