高糖對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中c-fos的影響研究

劉小鵬 孟曉軍 郭楊彬

糖尿病大血管病變是糖尿病常見的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥之一，血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂和損傷是其中一個(gè)重要的因素。c-fos是細(xì)胞內(nèi)的一種癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物Fos和Jun能形成異源二聚體，即有活性的轉(zhuǎn)錄因子AP-1，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成，從而參與細(xì)胞增殖、凋亡等過程。國(guó)內(nèi)外研究表明糖尿病時(shí)c-fos原癌基因參與了糖尿病大血管病變的病理生理過程，但c-fos原癌基因在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)情況極少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)的主要目的是觀察在高糖培養(yǎng)條件下，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中c-fos mRNA和蛋白的表達(dá)變化情況，為糖尿病的臨床和基礎(chǔ)研究提供有益的探索。

1 材料

新生兒臍帶:來自中山大學(xué)第五附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科健康產(chǎn)婦，無菌操作取下臍帶，置PBS溶液中浸泡，4℃冰箱保存，于4 h之內(nèi)使用;DMEM培養(yǎng)基(低糖型)、胎牛血清(FBS):Gibco公司產(chǎn)品;c-fos抗體:Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品，使用濃度為1:50;S-P試劑盒(含二抗羊抗兔):深圳晶美公司產(chǎn)品;AMV cDNA第一鏈合成試劑盒:BBI公司產(chǎn)品;引物:上海生工生物工程公司合成;PCR擴(kuò)增試劑盒:上海生工生物工程公司產(chǎn)品;Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體:ZYMED公司產(chǎn)品，使用濃度為1:100。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)［1］。

2.2 內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定 ①倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)。②Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將生長(zhǎng)良好的第2代或第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組如下:①對(duì)照組(Glu 5.5 mmol/L);②高糖組1(Glu 11 mmol/L);③高糖組2(Glu 22 mmol/L);④高糖組3(Glu 44 mmol/L);⑤甘露醇組(22 mmol/L)。并選取22 mmol/L Glu 分別作用0 h、1/2 h、1 h、2 h 為不同時(shí)間點(diǎn)。

2.4 總RNA的提取、cDNA的合成、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)按照試劑盒說明書進(jìn)行，引物序列如下:GAPDH［2］:上游引物:5 ’-GTC AGT GGT GGA CCT GAC CT-3’，下游引物:5 ’-AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG-3’，目的片段長(zhǎng)度:420 bp;c-fos［2］:上游引物:5 ’-AGA ATC CGA AGG GAA AGG AA-3’，下游引物:5 ’-CTT CTC CTT CAG CAG GTT GG-3’，目的片段長(zhǎng)度:150 bp。循環(huán)參數(shù)如下:GAPDH:94℃ 5 min 1 cycle;94℃ 40 s、58℃ 40 s、72℃ 60 s，30 cycles;72℃ 10 min 1 cycle。c-fos:94℃ 5 min 1 cycle;94℃ 40 s、54℃ 40 s、72℃ 60 s，30 cycles;72℃ 10 min 1 cycle。

2.5 免疫細(xì)胞化學(xué) 按照試劑盒說明書進(jìn)行(一抗為Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體、c-fos，陰性對(duì)照用0.01M PBS)。

3 結(jié)果

3.1 HUVECs的鑒定 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞融合后在倒置相差顯微鏡下觀察呈單層鋪路卵石樣免疫細(xì)胞化學(xué)見Ⅷ因子抗原胞漿顆粒狀表達(dá)，證實(shí)為95%以上的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。

3.2 高糖對(duì)c-fos基因表達(dá)的影響

3.2.1 總RNA的鑒定 總RNA提取產(chǎn)物在紫外分光光度計(jì)下測(cè)A260/A280的OD比值在1.8～2.0之間。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀下可見2條清晰的條帶，分別28 s、18 s，且28 s/18 s＞1.5，示 RNA 無明顯降解。

3.2.2 c-fos在HUVECs中的轉(zhuǎn)錄 PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后于凝膠圖像分析系統(tǒng)攝像，進(jìn)行灰度分析，結(jié)果見下圖1、2，c-fos和GAPDH擴(kuò)增片段分別為150 bp和420 bp，與理論設(shè)計(jì)相符。

圖1 不同處理因素對(duì)c-fos mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

圖2 22 mmol/L Glu作用不同時(shí)間c-fos mRNA轉(zhuǎn)錄

3.2.3 葡萄糖濃度對(duì)c-fos mRNA轉(zhuǎn)錄的影響 選取5.5 mmol/L、11 mmol/L、22 mmol/L、44 mmol/L 濃度組以觀察葡萄糖對(duì)c-fos基因轉(zhuǎn)錄的濃度影響。從圖1可以看出，各組GAPDH mRNA水平相差不大，但c-fos mRNA的量從5.5～22 mmol/L隨葡萄糖濃度增加而逐漸增高(P＜0.01)，22 mmol/L組達(dá)最高峰。其c-fos/GAPDH mRNA比值見表1。

表1 葡萄糖濃度對(duì)c-fos mRNA轉(zhuǎn)錄的影響(n=3)

3.2.4 葡萄糖作用時(shí)間對(duì)c-fos mRNA轉(zhuǎn)錄的影響 根據(jù)量效結(jié)果，選取22 mmol/L為作用濃度，觀察葡萄糖對(duì)c-fos基因表達(dá)的時(shí)間影響。從圖2可以看出，c-fos mRNA水平逐步增高，2 h組中表達(dá)降低(P＜0.01)。c-fos的灰度比值見表2。

表2 葡萄糖作用時(shí)間對(duì)c-fos mRNA轉(zhuǎn)錄的影響(n=3)

3.2.5 高糖對(duì)c-fos蛋白表達(dá)的影響 HUVECs經(jīng)過22 mmol/L高糖處理2 h免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)為陽(yáng)性(見下圖3)，而未經(jīng)高糖處理為陰性(見下圖4)。

圖3 22 mmol/L Glu作用2 h c-fos蛋白表達(dá)(S-P法40×)

圖4 正常Glu c-fos蛋白表達(dá)(S-P法40×)

3.2.6 甘露醇對(duì)c-fos轉(zhuǎn)錄的影響 從圖1可以看出，甘露醇組與相應(yīng)正常葡萄糖組比較，c-fos mRNA水平無明顯升高(P＞0.05)。相關(guān)灰度比值數(shù)據(jù)從略。

4 討論

c-fos屬于即刻早基因，正常情況下在大多數(shù)細(xì)胞都有極低水平的表達(dá)，參與細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、增殖、分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信息傳遞等生理過程。在受到多種傷害性時(shí)，能迅速表達(dá)，參與細(xì)胞的凋亡、修復(fù)等過程。但一般來說，其表達(dá)快速、短暫;mRNA半衰期短，不穩(wěn)定;并且通過亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)與Jun蛋白形成異源性二聚體復(fù)合物，即具有活性的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1，AP-1通過順式作用激活相關(guān)的基因，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)與蛋白質(zhì)的合成［3］。

本研究發(fā)現(xiàn)高糖(22 mmol/L)作用下，HUVECs中c-fos的mRNA水平在1 h左右達(dá)到高峰，隨后下降。隨葡萄糖濃度增高c-fos mRNA表達(dá)量也增加，葡萄糖濃度至22 mmol/L達(dá)最高峰，44 mmol/L時(shí)下降，其原因可能與葡萄糖濃度過高毒性作用增加抑制細(xì)胞活性等有關(guān)。c-fos蛋白表達(dá)也隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增高，至2 h達(dá)最高峰，隨后下降，與其他研究基本一致［4］。甘露醇組c-fos mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)無明顯增高。

高糖引起HUVECs c-fos轉(zhuǎn)錄和蛋白合成增加的原因未明，目前認(rèn)為可能與PKC通路激活有關(guān)，筆者前期的工作也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果。AP-1是PKC的經(jīng)典核內(nèi)靶分子。高糖激活PKC通路的機(jī)制如下:①?gòu)念^合成(de novo)途徑:高糖經(jīng)酵解產(chǎn)生中間產(chǎn)物，逐步?；铣蒁AG，此為高糖激活PKC的主要途徑;②磷脂酶D水解磷脂酰膽堿生成DAG途徑;③山梨醇通路激活、蛋白質(zhì)非酶糖化、氧化應(yīng)激均可使DAG生成增加而激活 PKC［5］。

筆者發(fā)現(xiàn)高糖時(shí)HUVECs中PKC通路激活一方面可以引起VEGF的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成增加［6］，因此可能導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，新生血管形成;另一方面引起c-fos轉(zhuǎn)錄和蛋白合成增加，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡［7］。具體哪方面因素何時(shí)占主導(dǎo)地位，可能是一個(gè)值得研究的課題。在此，不妨可以大膽假設(shè)一下:在糖尿病的早期，以第一條途徑為主，此時(shí)表現(xiàn)出來的是內(nèi)皮細(xì)胞增生，血管內(nèi)皮層較為完整;至中晚期，則第二條途徑占主導(dǎo)地位，因此出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，血管內(nèi)皮層的破壞，進(jìn)而出現(xiàn)糖尿病大血管的典型病變。

［1］王立巖，冬曉紅，宮桂蘭，等.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)、鑒定及形態(tài)觀察.白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，26(1):26-28.

［2］Shinichi Sakurai，Shahabuddin Alam，Glorivee Pagan-Mercado，et al.Retinal Capillary Pericyte Proliferation and c-fos mRNA Induction by Prostaglandin D2 through the cAMP Response Element.Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43:2774-2781.

［3］Liang F，Seyrantepe V，Landry K，et al.Monocyte differentiation upregulates the expression of the lysosomal sialidase，neul，and triggers its targeting to the plasma membrane via major histocompati-bility complex classⅡ-positive compartment.J Biol Chem，2006，281(37):27526-27530.

［4］宋冰，魏執(zhí)真，呂仁和.中藥糖心寧口服液對(duì)血管平滑肌細(xì)胞原癌基因c-myc和 c-fos表達(dá)的影響.中醫(yī)雜志，2004，45(4):292-294.

［5］Scivittaro V，Ganz MB，Weiss MF.AGEs induce oxidative stress and activate protein kinase C-βⅡ in neonatal mesangial cells.Am J Physiol，2000，278:F676-683.

［6］劉小鵬，羅春英，曹仁賢，等.高糖作用下HUVECs中VEGF基因表達(dá)與PKC通路的關(guān)系研究.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2006，14(1):17-20.

［7］羅春英，劉小鵬，文格波，等.p38絲裂素活化蛋白激酶在高糖損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的作用.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2006，14(10):853-856.