微透析－液相色譜－化學發(fā)光法測定大鼠腦組織中丹參酚類化合物濃度及其藥代動力學研究

張群林，張云靜，吳 亮，李 俊，袁 野

丹參為唇形科植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bge)的干燥根及根莖，是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥學中應(yīng)用最早且最廣泛的藥物之一，其化學成分主要包括水溶性酚類化合物和脂溶性二萜醌類化合物。丹參滴注液是我國自主研發(fā)的中藥注射液，由丹參水提液制備而成，已應(yīng)用于臨床治療心腦血管疾病30余年。丹參素(DSS)、原兒茶醛(PAL)和丹酚酸B(SalB)是丹參滴注液中主要的水溶性有效成分(化學結(jié)構(gòu)式見Fig 1)，具有改善血液循環(huán)、擴張冠脈、減少腦梗死面積、抑制腎素血管緊張素系統(tǒng)、清除自由基和抗骨質(zhì)疏松等藥理作用［1－3］。近期研究［4］發(fā)現(xiàn)丹參注射液對大鼠腦組織損傷具有良好的保護作用，但丹參酚類化合物在腦組織藥代動力學研究的報道較少。目前國內(nèi)外測定腦組織中藥物含量多采取組織勻漿法［5］或抽取腦脊液［6］進行測定，存在離體、干擾生命過程、樣品處理繁瑣和易被污染等缺點。微透析取樣技術(shù)可在基本不干擾生物體內(nèi)正常生命過程的情況下進行在體取樣，樣品因不含蛋白質(zhì)等大分子化合物，可不經(jīng)預(yù)處理直接用于測定游離藥物的濃度。微透析樣品具有樣本量少、藥物含量低等特點，因此需要高靈敏的分析方法。液相色譜－化學發(fā)光(HPLC-CL)聯(lián)用技術(shù)具有高選擇性、高靈敏度、寬線性范圍等優(yōu)點，適用于微透析樣品的分析。本研究基于丹參酚類化合物對HAuCl4-luminol-H2O2化學發(fā)光的增強作用，建立了HPLC-CL分析法測定大鼠腦微透析液中DSS、PAL和SalB 3種酚類化合物濃度的新方法，并將其成功地應(yīng)用于丹參酚類化合物在腦組織的藥代動力學研究，為進一步闡明丹參水溶性成分對腦組織保護的作用機理提供科學依據(jù)。

Fig 1 Chemical structures of danshensu(DSS)，protocaechuic aldehyde(PAL)，and Salviandic acid B(SalB)

1 儀器與試劑

1.1 儀器 HPLC-CL分析系統(tǒng)包括島津LC-20高效液相色譜儀(20 μl定量環(huán)，四元泵，DAD檢測器)，IFFM-E蠕動泵、IFFS-A化學發(fā)光檢測器(西安瑞邁電子科技有限公司)。腦立體定位儀(ZH-藍星，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)。微透析系統(tǒng)包括CMA/400微量注射泵和CMA/150動物恒溫控制器(CMA，Stockholm，瑞典)。超純水系統(tǒng)(Millipore，USA)。腦探針(CMA/12，膜長4 mm，截留分子質(zhì)量2×104)。

1.2 藥品與試劑 DSS和PAL對照品購自中國藥品生物制品檢定所，SalB對照品購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。魯米諾貯備液:取魯米諾(Merck，Darmstadt，Germany)適量，溶于 0.10 mol·L－1的NaOH中，制得0.1 mmol·L－1的貯備液，常溫避光保存。H2O2工作液由0.3 g·ml－1H2O2(宿州化學試劑有限公司)新鮮稀釋而成。HAuCl4·4H2O(上海試劑一廠)溶于水制得 0.01 g·ml－1的HAuCl4。丹參滴注液(安徽天洋藥業(yè)有限公司，批號:100306，規(guī)格:250 ml∶16 g)。流動相甲醇為色譜醇，其它試劑為分析純，所用水為超純水(18.3 MΩ cm，Millipore，USA)。灌流液為林格液(NaCl 122，KCl 3，KH2PO40.4，MgSO41.2，NaHCO325 和CaCl21.2 mmol·L－1)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的配制 分別取DSS、PAL和SalB對照品，精密稱定，置25 ml棕色量瓶中用甲醇稀釋至刻度。得到濃度分別為2.0×10－4、2.2×10－4和2.0 ×10－4g·ml－1的 DSS、PAL、和 SalB 對照品貯備液，置4℃冰箱保存。分別取3種貯備液適量，加超純水制成每 1 ml含 DSS 0.32 μg、PAL 0.35 μg 和SalB 0.32 μg的混合對照品溶液。

2.2 丹參滴注液供試品溶液的配制 取丹參滴注液1 ml，置100 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，取該溶液1 ml，置50 ml量瓶中加水稀釋至刻度，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱:Shim pack ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相 A:水(含 0.1%磷酸，V/V)，B:甲醇(含0.1%磷酸，V/V);采用梯度洗脫(0～15 min，25% ～ 50%B，15 ～ 30 min，50%B)，流速為1.0 ml·min－1;柱溫 30℃;進樣量:20 μl。檢測器:二極管陣列檢測器(DAD)和化學發(fā)光(CL)檢測器同時串聯(lián)檢測。

2.4 化學發(fā)光條件 魯米諾:20 μmol·L－1;H2O2溶液:50 μmol·L－1;HAuCl4溶液:40 mg·L－1。化學發(fā)光試劑流速:2.0 ml·min－1，光電倍增管電壓:－600 V。

2.5 化學發(fā)光條件的選擇 從發(fā)光效率、穩(wěn)定性和兼容性等方面對化學發(fā)光流路進行優(yōu)化選擇。優(yōu)化實驗中所用的酚類化合物濃度分別為DSS 86.08、PAL 87.52 μg·L－1、SalB 82.56 μg· L－1，電壓－900 V。

3種酚類化合物經(jīng)液相色譜分離后先與HAuCl4溶液混合，再與H2O2溶液混合，最后于魯米諾溶液混合，所得的發(fā)光信號最穩(wěn)定且最強。若魯米諾與H2O2的混合順序調(diào)換，則基線噪聲明顯增大。

考察了 pH 9.16～13.00范圍內(nèi)的 NaHCO3、Na2CO3、Na2CO3和NaOH溶液對發(fā)光光強的影響，見Fig 2A。當pH低于9.50時，DSS、PA和CA的增強峰非常微弱，且PAL呈現(xiàn)倒峰，SalB和SalA無信號。Cui等［7］發(fā)現(xiàn) luminol-H2O2-Co2+發(fā)光體系中，當pH在一定范圍內(nèi)時，一些具有鄰羥基的酚類化合物可同時出現(xiàn)增強和抑制峰。采用pH 10.83的NaHCO3-Na2CO3緩沖液時，待測酚類化合物的發(fā)光信號最強。可能是由于碳酸鹽對luminol-H2O2體系的發(fā)光有增強作用［8］。而當魯米諾溶于pH 11.00或pH 12.00的NaOH溶液中時，基線和發(fā)光信號均消失。當NaOH溶液的pH達到13.0時，可觀察到基線，但待測酚類化合物無信號。

實驗考察了pH 10.83 NaHCO3-Na2CO3緩沖介質(zhì)中0.8 ～50.0 μmol·L－1濃度范圍內(nèi)魯米諾對發(fā)光強度的影響。當魯米諾濃度達到20.0 μmol·L－1時3種待測酚類化合物的發(fā)光強度最大，見Fig 2B。

實驗考察了 20.0 ～80.0 μg·L－1濃度范圍內(nèi)的HAuCl4對發(fā)光強度的影響，見圖2C。當HAuCl4濃度達到40.0 mg·L－1時，3種待測酚類化合物的發(fā)光強度最大。

實驗考察了 0.01～0.5 mmol·L－1的 H2O2對發(fā)光強度的影響。待測物的發(fā)光強度隨H2O2濃度的增加而增加，見Fig 2D，當H2O2濃度高于0.05 mmol·L－1時，基線噪聲明顯增加，發(fā)光信號的重現(xiàn)性降低。

考察了0.6～2.3 ml·min－1流速對發(fā)光強度的影響，見Fig 2E。當流速低于2.0 ml·min－1時，3 種酚類化合物的發(fā)光強度隨流速的增加而增加，當高于此流速時，發(fā)光強度開始下降且基線開始波動。

Fig 2 Effects of(A)pH of Na2CO3-NaHCO3buffer;(B)concentra-tion of luminol;(C)concentration of HAuCl4;(D)concentration of H2O2;(E)flow rate on the relative CL intensities

2.6 微透析樣品的采集 ♂Spraque-Dawley(SD)大鼠，清潔級，體質(zhì)量(300±20)g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

6只♂ SD大鼠腹腔注射水合氯醛(300 mg·kg－1)麻醉后用腦立體定位儀固定大鼠，將腦探針植入左側(cè)皮質(zhì)(前囟后0.8 mm，旁左開1.5 mm，深4.0 mm)，用林格液以 2.0 μl·min－1的流速灌流，平衡時間為2 h，連續(xù)收集3個空白透析液樣品后大鼠尾靜脈注射丹參滴注液(DSS 2.5 mg·kg－1、PAL 0.4 mg·kg－1、SalB 0.4 mg·kg－1)并收集樣品，腦透析液收集時間間隔為15.0 min。實驗過程中用動物恒溫控制器使動物體溫保持37℃，收集樣品置4℃冰箱中保存，0.25和0.5 h的樣品用林格液稀釋兩倍后進樣，在12 h內(nèi)完成測定。

2.7 探針回收率的測定 將探針置入已知濃度(Cs)的對照品溶液中，以腦微透析相同的灌流液、流速和時間間隔收集體外透析液，進行按前述色譜條件進行測定透析液中待測物的濃度(Cdial)，計算探針的體外回收率:Rinvitro=Cdia/Cs［9］。

將探針植入大鼠大腦皮質(zhì)，用含有已知濃度(Cperf)對照品的林格液灌流，流速和時間間隔收集透析液，進行按前述色譜條件進行測定透析液中待測物的濃度(Cdial)，計算探針的體內(nèi)回收率:Rinvivo=(Cperf～ Cdial)/Cperf［10］。

2.7.1 流速對探針回收率的影響 將腦探針浸入含有DSS、PAL和SalB的混合對照品溶液中(DSS、PAL和 SalB的濃度分別為 327.68、352.00和480.00 μg·L－1)，用空白林格液在不同流速(2.5、2.0、1.5、1.0 μl·min－1)下灌注腦探針，每種流速下每支探針收集3個微透析樣品，每次15 min，測定各流速下探針的回收率，回收率隨流速的增加而降低，結(jié)果見Tab 1。

Tab 1 Effects of perfusing rate on the recovery of probeˉ ± s，n=3)

Tab 1 Effects of perfusing rate on the recovery of probeˉ ± s，n=3)

Phenolic Perfusing rate/μl·min －1Recovery/%DSS 2.5 10.10 ±0.98 2.0 12.59 ±0.37 1.5 15.57 ±1.02 1.0 20.10 ±0.90 PAL 2.5 12.40 ±1.02 2.0 15.36 ±0.61 1.5 18.73 ±0.71 1.0 22.02 ±2.24 SalB 2.5 7.70 ±0.34 2.0 10.12 ±0.51 1.5 10.81 ±1.02 1.0 11.60 ±1.12

2.7.2 待測物濃度對探針回收率的影響 分別測定了腦探針對不同濃度的DSS、PAL和SalB的體外及體內(nèi)回收率，結(jié)果表明(Tab 2)，體外和體內(nèi)回收率大小與藥物濃度無關(guān)。體內(nèi)回收率均高于體外回收率，可能是由于體內(nèi)溫度為37℃，高于體外的溫度(室溫20℃)，而較高的溫度下，物質(zhì)在組織中的擴散增加，分子熱運動也增加，增大了物質(zhì)擴散進微透析膜中的概率，引起物質(zhì)轉(zhuǎn)移系數(shù)值的變化，相對回收率隨之增加。Menachery等［11］對這一現(xiàn)象做了深入的研究。

Tab 2 Effects of analytes’concentration on the recover of probe±s，n=3)

Tab 2 Effects of analytes’concentration on the recover of probe±s，n=3)

Phenolic Concentration/μg·L －1 In vivo recovery/%In vitro recovery/%DSS 26.21 13.93 ±1.02 11.55 ±1.00 327.68 14.82 ±0.62 12.59 ±0.37 Average 14.38 ±0.04 12.07 ±0.06 PAL 30.80 16.71 ±1.01 14.05 ±1.20 352.00 18.81 ±0.98 15.30 ±0.61 Average 17.76 ±0.08 15.18 ±0.01 SalB 48.00 14.06 ±0.37 11.06 ±0.49 480.00 13.64 ±0.72 10.12 ±0.51 Average 13.98 ±0.02 10.59 ±0.06

2.7.3 增量法與減量法測定回收率的比較 用增量法和減量法分別測定了腦探針在3 h內(nèi)對DSS、PAL和SalB的體外回收率，結(jié)果分別見Fig 3A～3C。增量法測定探針對DSS、PAL和SalB的回收率的RSD分別為4.96%、4.08%和4.97%;腦探針對DSS、PAL和SalB的回收率的RSD分別為3.13%、4.03%和3.71%。表明探針的回收率在3 h內(nèi)保持穩(wěn)定。兩種方法測定DSS、PAL和SalB的回收率的RSD分別為6.5%、4.8%和6.5%，表明探針DSS、PAL和SalB的回收率和傳遞率相等。

2.8 數(shù)據(jù)處理 用體內(nèi)回收率(Rinvivo)，將測得腦透析液中待測物濃度(Cm)折算為大鼠腦組織中的濃度(Cf):Cf=Cm/Rinvivo。所得的腦組織中待測藥物濃度－時間數(shù)據(jù)，用Drug And Statistics 2.0(DAS 2.0)軟件進行分析，用統(tǒng)計矩求算藥代動力學參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 色譜行為 在上述色譜條件下，DSS、PAL和SalB得到較好的分離，保留時間分別為5.7、8.8和21.4 min。丹參滴注液供試品溶液的HPLC-CL圖譜見Fig 4A，空白腦微透析液的圖譜見Fig 4B，空白腦微透析液加入DSS、PAL和SalB對照品的HPLC-CL圖譜見Fig 4C，丹參滴注液給藥后0.5 h收集的腦微透析液圖譜見Fig 4D。

Fig 3 In vitro recoveries of brain probes for DSS，PAL and SalB in 3 h determined by gain(■)and loss(▲)

3.2 線性關(guān)系及檢測限 由于透析液微透析采樣所的樣品中不含有蛋白等基質(zhì)，因此一般方法學考察都是在空白灌流液中進行。取林格液(灌流液)加入DSS、PAL和SalB 3種酚類化合物配成系列工作溶液。以每種酚類化合物的相對發(fā)光強度的對數(shù)(lgΔI)對其質(zhì)量濃度(單位:μg·L－1)的對數(shù) lgC進行線性回歸，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見Tab 3。各酚類化合物的線性關(guān)系良好(r＞0.990)，檢測限較低。

3.3 精密度和準確度 取空白林格液，分別加入DSS、PAL和SalB制備低、中、高3個濃度的質(zhì)量控制樣品(DSS 4.07、26.21、327.68 μg·L－1，PAL 8.80、30.08、352.00 μg·L－1，SalB 16.00、48.00 和640.00 μg·L－1)，日內(nèi)每個濃度測定 5 次，計算RSD;連續(xù)5 d每日測定5次，計算RSD，以標準曲線法計算濃度與真實濃度的百分比計算準確度。日內(nèi)和日間RSD均小于5.5%，3種酚類化合物的準確度在95.09到103.55%范圍內(nèi)，結(jié)果見Tab 4。

3.4 丹參滴注液含量測定 分別精密吸取供試品溶液與對照品溶液各20 μl，按“1.2”的分析條件進行測定，結(jié)果丹參滴注液中DSS、PAL和SalB的含量分別為 0.49、0.079 和0.078 g·L－1(n=6)。

Fig 4 Representative HPLC-CL chromatograms

Tab 3 Calibration curves，linear ranges，and LODs for DSS，PAL，and SalB in Ringer's solution of the HPLC-CL method

Tab 4 Precisions and accuracies for DSS，PAL，and SalB in Ringer’s solution of the HPLC-CL method( ± s，n=5)

Tab 4 Precisions and accuracies for DSS，PAL，and SalB in Ringer’s solution of the HPLC-CL method( ± s，n=5)

Compound AddedIntra-dayAccuracy/% RSD/% Inter-dayAccuracy/% RSD/%/μg·L －1measured/μg·L －1 measured/μg·L －1 DSS 4.07 3.90 ±0.14 95.82 3.59 3.87 ±0.16 95.094.13 26.21 25.72 ±1.02 98.13 3.96 25.98 ±1.42 99.12 5.46 327.68 330.24 ±6.96 100.78 2.11 331.63 ±7.90 101.20 2.38 PAL 8.80 8.53 ±0.43 96.93 5.04 8.49 ±0.38 96.48 4.47 30.80 30.87 ±1.64 100.23 5.31 29.76 ±1.56 96.62 5.24 352.00 342.20 ±8.39 97.22 2.45 353.98 ±8.98 100.56 2.53 SalB 16.00 15.60 ±0.74 97.50 4.74 15.32 ±0.75 95.75 4.89 48.00 49.08 ±1.99 102.25 4.05 47.94 ±2.06 99.87 4.29 640.00 647.07 ±18.77 101.10 2.90 662.76 ±16.96 103.56 2.56

3.5 腦部藥動學研究 丹參滴注液單次給藥后(DSS 2.5 mg·kg－1、PAL 0.4 mg·kg－1、SalB 0.4 mg·kg－1，iv)在大鼠腦微透析液中檢測到 DSS，而未檢測到PAL和SalB。與蛋白結(jié)合的藥物因不能透過半透膜被排斥在探針外，只有游離的藥物會沿濃度梯度擴散，被灌流液帶出，因此腦微透析液中的丹參素只是游離的部分。經(jīng)體內(nèi)回收率折算所得的DSS的腦組織液游離藥物濃度–時間曲線見Fig 5，其主要藥代動力學參數(shù)見Tab 5。

Fig 5 Unbound DSS concentration versus time curve of brain after single administration of Danshen injection(DSS 2.5 mg·kg－1，iv)to SD rats±s，n=6)

Tab 5 Pharmacokinetic parameters of danshensu in rat brain after single administration of Danshen injection(3.5 mg·kg－1，iv)(±s，n=6)

Tab 5 Pharmacokinetic parameters of danshensu in rat brain after single administration of Danshen injection(3.5 mg·kg－1，iv)(±s，n=6)

Parameter Estimate T 12/h 0.64±0.20 AUC0－∞ /μg·h·L－1 369.39 ±114.77 MRT0－∞ /h 0.64±0.18 K 1.36±0.27

4 討論

4.1 色譜條件的選擇 本實驗中，液相色譜的流動相不僅要使DSS、PAL和SalB得到良好的分離，而且應(yīng)與HAuCl4-luminol-H2O2化學發(fā)光檢測系統(tǒng)相兼容。實驗中采用了甲醇－乙酸－水［12］，甲醇－甲酸－水，甲醇－磷酸－水，乙腈－乙酸－水等流動相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動相中乙酸和甲酸的加入，會導致化學發(fā)光信號的熄滅，而乙腈作為有機相并不能改善化學發(fā)光基線的漂移。因此，本實驗中我們采用0.1%磷酸(V/V)－0.1%磷酸甲醇(V/V)為流動相進行梯度洗脫，流速1.0 ml·min－1。3種水溶性成分在22 min內(nèi)得到了良好分離。

4.2 微透析采樣條件的選擇 實驗結(jié)果顯示，探針周圍待測物濃度對探針的回收率無影響;探針回收率隨著灌流速度的增加而降低。在低流速下，探針滲透膜內(nèi)外溶液的擴散接近平衡，因此相對回收率較高;但在低流速下，在單位時間內(nèi)收集到的滲析樣品體積較小。需要較長的采樣時間以收集足夠體積的樣品供HPLC進樣，將降低時間分辨率而丟失部分濃度變化信息時，灌流速度過大時，將破壞大鼠正常生理狀態(tài)。綜合考慮上述因素，本實驗最終確定以 2.0 μl·min－1的灌流速度和 15 min 的采樣間隔，收集腦微透析樣品。

4.3 腦組織藥代動力學研究 部頒標準［13］僅以原兒茶醛作為丹參滴注液的質(zhì)控指標。近代藥理研究發(fā)現(xiàn)丹參注射液對大鼠腦組織損傷具有良好的保護作用，但到底是哪種成分易于透過血腦屏障而發(fā)揮作用，尚未有結(jié)論。故本研究在丹參滴注液部頒標準的基礎(chǔ)上選用DSS、PAL和SalB 3種酚類化合物作為考察指標，建立其在大鼠給藥丹參滴注液后腦微透析液中的含量測定方法，對腦組織中游離的丹參酚類化合物進行監(jiān)測。

丹參滴注液單次尾靜脈給藥后，在腦透析液中可檢測到DSS，但未檢測到PAL和SalB，可能原因有:其一，PAL和SalB不易透過血腦屏障;其二，與3種丹參酚類化合物的蛋白結(jié)合率有關(guān)。與蛋白結(jié)合的藥物因不能透過半透膜被排斥在探針外，只有游離的藥物會沿濃度梯度擴散，被灌流液帶出。Yang等［14］報道PAL的體外大鼠血漿蛋白結(jié)合率約為55%-75%，SalB高達80%以上，而DSS僅為5%左右，故腦組織中游離PAL和SalB含量可能極低，低于本法的檢測限。

為進一步驗證，取大鼠給藥后20 min的腦組織勻漿和血液經(jīng)預(yù)處理后測定，發(fā)現(xiàn)腦組織勻漿和血漿中均測得DSS和SalB而未測得PAL。說明SalB能夠透過血腦屏障，可能由于蛋白結(jié)合率高，游離的SalB少，采用微透析法未能測得游離的SalB。而PAL則可能在體內(nèi)迅速被代謝，有文獻［15］報道丹參水溶性提取物中的其他成分使原兒茶醛在大鼠體內(nèi)吸收減少、消除變快;另有文獻［16］報道，質(zhì)譜分析結(jié)果表明原兒茶醛在體內(nèi)易被氧化為原兒茶酸。

丹參滴注液給藥后0～15 min的透析液中可檢測到DSS，15～30 min的透析液中DSS濃度最高。說明DSS易于透過血腦屏障，且在腦中分布較迅速，提示丹參素為一個潛在的腦部保護劑，該結(jié)果為丹參滴注液的腦組織損傷保護的作用機制提供了科學依據(jù)，并為中藥丹參治療腦部疾病的臨床應(yīng)用提供了有效信息。

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