鈍化NF-κB的活化對酒精性肝損傷大鼠CYP3A的影響

康曉琳，薛永志，許秀舉，劉和莉

長期過量飲酒導(dǎo)致的酒精及其代謝產(chǎn)物對肝臟的毒性作用、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、細胞因子和免疫反應(yīng)等多種因素有關(guān)的肝細胞損傷，已經(jīng)成為繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損害的第二大病因［1］。CYP3A是CYP450氧化代謝酶超家族中含量最多的亞型，參與該酶系中50%以上外源性藥物、毒物或致癌物等氧化代謝［2－3］，但在酒精性肝損傷過程中是否參與其中，不同實驗室得出截然不同的結(jié)果，并且其確切機制尚未明確［4－5］。NF-κB 在炎癥及免疫反應(yīng)中被高度誘導(dǎo)，并且對氧化應(yīng)激敏感，在肝臟炎癥、纖維化及肝細胞再生、脂質(zhì)過氧化等病理生理過程中起著重要作用［6－7］。Wahl等［8］發(fā)現(xiàn)柳氮磺胺吡啶(salazosulfapyridine，SASP)可以通過抑制 IκB的磷酸化從而發(fā)揮抑制NF-κB的作用，因此可以阻止NF-κB向核內(nèi)移位，減少下游細胞因子的表達。本研究以白酒灌胃法制備大鼠酒精性肝損傷模型［9］，觀察 CYP3A 的代謝活性、NF-κB 蛋白表達有何變化，采用SASP抑制NF-κB，觀察對CYP3A氧化代謝活力和肝功能的影響，深入探討NF-κB在酒精性肝損傷中的作用及其作用環(huán)節(jié)，為酒精性肝臟疾病藥物治療提供新的靶點和思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 清潔級♂Wistar大鼠48只，體質(zhì)量(200±20)g，動物許可證號:SCXK(蒙)2002－0001，購自內(nèi)蒙古大學實驗動物中心。柳氮磺胺吡啶(salazosulfapyridine，SASP)，上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司，批號:H31020557;56度紅星二鍋頭由北京紅星股份有限公司生產(chǎn);咪噠唑侖(midazolam，MDZ)注射劑，徐州恩華集團藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)，10 mg/2 ml/支，批號:20080604;兔抗大鼠NF-κB p65多克隆抗體，即用型SABC免疫組化試劑盒，DAB顯色劑均購于武漢博士德生物工程有限公司;其它藥品均為分析純。

1.2 主要儀器 高效液相色譜儀，Thermo Finnigon公司生產(chǎn);RH-200智能熱板儀，成都泰盟科技有限公司生產(chǎn);sartorius分析天平，北京塞多利斯儀器有限公司;CX41RF奧林帕斯顯微鏡;形態(tài)分析系統(tǒng)，江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司。

1.3 動物分組及建模方法 Wistar大鼠48只，經(jīng)1周的喂養(yǎng)適應(yīng)后，隨機分為3組，第1組(Control，n=16)經(jīng)灌胃給予NS 2 ml/次，1天2次，至20 d;第2組(Ethanol，n=16)給予56度紅星二鍋頭，10 mg·kg－1，1天 2次灌胃，至 20 d;第 3組(Ethanol+SASP，n=16)將 SASP(0.75 mg·kg－1)溶于白酒(10 mg·kg－1)中，1 天2 次灌胃，至20 d 末，于當晚禁食，d 21先將所有大鼠稱重，再將3組大鼠每組中的8只經(jīng)腹腔注射給予CYP3A探針MDZ(10 mg·kg－1)，并于給藥后15、30、45、60、120 min 各時間點經(jīng)眼內(nèi)眥靜脈叢采血0.5ml，置肝素化試管中，3 500 r·min－110 min，分離血漿，置 －20℃冰箱冷凍，按文獻［10］采用HPLC法進行咪噠唑侖血藥濃度經(jīng)時變化的測定。再斷尾取血4 ml，3 500 r·min－1離心10 min，抽取血清2 ml，置 －20℃冰箱冷凍，待測血清中ALT、AST水平。另外每組其余8只大鼠經(jīng)腹腔注射給予CYP3A的探針藥物MDZ(0.5 mg·kg－1)，并于給藥40 min后，將大鼠置于50℃熱板上，同時計時，記錄大鼠第1次舔后足的時間，作為反應(yīng)時間，并記錄大鼠5 min內(nèi)舔后足的次數(shù)。隨后將大鼠頸椎脫臼處死，迅速剖取肝臟，稱重，將肝組織浸泡于事先配好的甲醛酒精(甲醛 ∶酒精=1∶9)固定液中，做石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色及免疫組織化學測定。

1.4 肝組織NF-κB免疫組化染色 肝組織石蠟切片NF-κB免疫組化染色方法按試劑盒說明書進行，一抗稀釋倍數(shù)為1∶100。每張切片選擇染色良好區(qū)域，隨機觀察10個高倍視野。NF-κBp65以細胞染成棕黃色為陽性，采用形態(tài)分析系統(tǒng)統(tǒng)計每個視野中陽性細胞數(shù)、灰度、平均吸光度(average absorbance，AA)和積分吸光度 (integrated absorbance，IA)。細胞陽性率以每高倍鏡下陽性細胞數(shù)(細胞數(shù)/高倍鏡視野)來表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般狀態(tài)及肝臟病理學、生化指標的改變 經(jīng)過20 d酒精刺激，Ethanol組大鼠表現(xiàn)為體重增加量明顯減少(P＜0.01)，肝重系數(shù)增大(P＜0.01);而Ethanol+SASP組大鼠體重增加量是Ethanol組的1.2倍，肝重系數(shù)大于Control組，小于比Ethanol組。光鏡下可見，Ethanol組肝小葉界限不清，肝細胞出現(xiàn)空泡變性，同時散在淋巴細胞及單核細胞。Ethanol+SASP組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，但肝竇輕度狹窄。肝細胞內(nèi)無明顯空泡及疏松，部分肝細胞呈輕度濁腫。Ethanol組大鼠血清AST、ALT均較對照組升高，以ALT升高為明顯。Ethanol+SASP組血清ALT和AST較Ethanol組有所降低(Tab 1)。

Tab 1 Rat body weight gain，liver weight/body weight，serum ALT and AST levels in all groups(±s，n=8)

Tab 1 Rat body weight gain，liver weight/body weight，serum ALT and AST levels in all groups(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs ethanol

Group Total body weight gain/g Liver/%of body weight ALT/U·L－1 AST/U·L －1 Control 62.50 ±22.31 3.78 ±0.24 74.67 ±7.83 104.67 ±13.83 Ethanol 29.17±13.20＊＊ 5.35±0.60＊＊ 87.17±12.40＊＊125.66 ±15.88*Ethanol+SASP 35.00 ±1.41 4.88 ±0.61* 77.00 ±4.38#109.50 ±12.95

Fig 1 Pathological features in liver(HE×400)A:Control group;B:Ethanol group;C:Ethanol+SASP group

2.2 各組大鼠CYP3A代謝活力的變化 3組大鼠經(jīng)腹腔給予經(jīng)CYP3A代謝的探針藥物咪噠唑侖(10 mg·kg－1)，經(jīng)HPLC測得大鼠血漿中咪噠唑侖血藥濃度的經(jīng)時變化如Tab 2、3所示，Ethanol組在給藥后各時間點血漿中咪噠唑侖血藥濃度均明顯低于Control組(P ＜0.01)，、AUC 、Cmax均減小(P ＜0.01)，Ethanol+SASP 組抑制 NF-κB 后，血漿中咪噠唑侖血藥濃度明顯高于Ethanol組(P＜0.05)，AUC、Cmax明顯增大(P＜0.01)。從Tab 4可以看出Ethanol組與Control組相比，在給予咪噠唑侖40 min后，大鼠的反應(yīng)時間明顯縮短(P＜0.01)，5 min內(nèi)舔足次數(shù)也明顯增多(P＜0.01)，而Ethanol+SASP組大鼠反應(yīng)時間與Ethanol組相比有明顯延長(P＜0.05)，而舔足次數(shù)明顯減少(P＜0.01)。

2.3 各組大鼠NF-κB變化 光鏡下，大鼠肝組織NF-κBp65的陽性細胞呈明顯的棕黃色或深棕色，分布于細胞質(zhì)和細胞核，表達強度不一，以中央靜脈周圍表達多(Fig 2)。與Control組相比，Ethanol組肝細胞的NF-κBp65細胞陽性率明顯增高(P＜0.01)，灰度明顯降低(P＜0.01)，AA降低(P＜0.01)，IA增高(P＜0.01)。而Ethanol+SASP組與Ethanol組相比大鼠肝組織中的NF-κBp65細胞陽性率降低(P＜0.01)，灰度明顯回升(P＜0.01)，IA值明顯減小(P＜0.01)，而AA值差異未見顯著性，見Tab 5。

3 討論

白酒灌胃20 d成功復(fù)制了大鼠急性酒精性肝損傷模型，表現(xiàn)為大鼠肝重增加，功能受損，肝細胞出現(xiàn)輕度脂肪樣變。白酒灌胃法與酒精灌胃法相比更與人類的酒精性肝損傷接近，并有大量文獻支持［11］。目前，關(guān)于酒精性肝損傷過程中CYP3A代謝活力是否增強不同實驗室得出不同的結(jié)果，有報道［4］，中度酒精性肝損傷CYP3A活力無變化，但是減少咪噠唑侖口服生物利用度，可能是腸內(nèi)CYP3A誘導(dǎo)的結(jié)果。還有報道［5］，中度酒精性肝損傷與CYP3A活力密切相關(guān)，明顯增加其代謝活力，但CYP3A上調(diào)機制尚未明確，可能與核受體轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)有關(guān)。研究認為［12］，當血液和肝組織乙醇濃度較低時，大部分乙醇由乙醇脫氫酶氧化代謝，但大量飲酒而使肝組織乙醇濃度超過0.01 mol·L－1時，細胞色素P450混合功能氧化酶系統(tǒng)被激活。本研究結(jié)果表明，酒精損傷可導(dǎo)致CYP3A代謝能力增強，肝臟NF-κB的蛋白表達明顯增加。本研究結(jié)果與文獻［5，11］報道一致。

Tab 2 Plasma MDZ levels in all groups( ± s，n=8)

Tab 2 Plasma MDZ levels in all groups( ± s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs ethanol

Time/min 15 30 45 60 120 Control/mg·L －1 4.14 ±0.70 2.58 ±0.46 1.49 ±0.11 1.17 ±0.17 0.39 ±0.15 Ethanol/mg·L－1 1.92 ±0.19＊＊ 0.68 ±0.13＊＊ 0.39 ±0.23＊＊ 0.25 ±0.07＊＊ 0.01 ±0.02＊＊Ethanol+SASP/mg·L－1 2.91 ±0.18# 1.54 ±0.41# 0.78 ±0.16# 0.47 ±0.11# 0.19 ±0.09#

Tab 3 Plasma MDZ pharmacokinetic Levels in all groups(±s，n=8)

Tab 3 Plasma MDZ pharmacokinetic Levels in all groups(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs ethanol

T 1/min AUCCmax Group Ke 2/mg·min·L －1/mg·L －1 Control 0.010 ±0.003 75.006 ±17.507 238.160 ±29.253 4.144 ±0.701 Ethanol 0.021 ±0.005＊＊34.380±8.673*101.186±9.411＊＊1.918±0.190＊＊Ethanol+SASP 0.013 ±0.005 58.925 ±16.866 162.614 ±13.342##2.911 ±0.181##

Tab 4Sedation of MDZ in all groups(±s，n=8)

Tab 4Sedation of MDZ in all groups(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs ethanol

Duration of licking/s Licking times/times Control 37.87 ±7.42 31.67 ±7.66 Ethanol 26.31 ±7.67＊＊ 59.00 ±9.08＊＊Ethanol+SASP 35.75 ±6.74# 43.54 ±7.87##

Fig 2 Immunohistochemistry of NF-κB p65 expression in rat liver(SP×400)A:Control group;B:Ethanol group;C:Ethanol+SASP group

Tab 5 Number of NF-κB p65 positive cells/high-power field in all groups(±s，n=4)

Tab 5 Number of NF-κB p65 positive cells/high-power field in all groups(±s，n=4)

＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs ethanol

Number of positive cells/high power field/% Gray Average absorbance(AA)Integrated absorbance(IA)Control 9.21 ±3.96 207.77 ±5.37 0.24 ±0.01 2.82 ±0.15 Ethanol 33.49±12.12＊＊401.61±44.78＊＊ 0.36±0.04＊＊ 31.60 ±12.41＊＊Ethanol+SASP 19.37±8.08## 301.93±29.16## 0.23±0.03 3.91 ±1.92##

應(yīng)用SASP鈍化NF-κB的活化，大鼠肝臟NF-κB的蛋白表達減少，CYP3A的代謝活力下調(diào)，同時肝臟脂肪變性程度減輕，且血清AST、ALT含量明顯下降。酒精肝損傷后，能使腸粘膜屏障受損，腸道通透性增加，并且肝臟巨噬細胞的吞噬能力下降，致使機體內(nèi)毒素如脂多糖(LPS)等的水平上升，導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥。內(nèi)毒素可以通過結(jié)合枯否細胞上CD14受體來激活NF-κB，活性氧(ROS)可能是所有刺激物激活NF-κB共同機制和LPS誘導(dǎo)細胞信號系統(tǒng)的核心，ROS增殖能減少巰基來增加細胞被氧化比例，調(diào)節(jié)NF-κB激活，NF-κB可以增加氧化信號通路的敏感性，導(dǎo)致基因產(chǎn)物的增多［13－14］。抑制NF-κB的活化對酒精性肝損傷具有一定保護作用，一方面是由于在NF-κB的活化受到抑制后，其調(diào)控的下游炎性細胞因子轉(zhuǎn)錄減少，從而減輕肝臟的炎癥損傷;另一方面，抑制NF-κB可以扭轉(zhuǎn)CYP3A代謝活力的上調(diào)，減少活性氧族的產(chǎn)生，減少肝細胞的脂質(zhì)過氧化，同時減少了ROS作為第二信使對NF-κB的活化，形成一種良性循環(huán)。有關(guān)酒精性肝損傷過程中CYP3A代謝活力的調(diào)控是否經(jīng)由NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控，可否通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控代謝酶活力干預(yù)損傷過程有待進一步深入研究。

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