山葡萄素抗動脈粥樣硬化分子機制研究

李韶菁，黃 峰，藍(lán) 希，杜冠華

心腦血管疾病是現(xiàn)今危害人體健康和生命最嚴(yán)重的病癥之一，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率，是中老年人常見病和多發(fā)病。而動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)。

目前認(rèn)為AS病因相對復(fù)雜，是由多種危險因子相互關(guān)聯(lián)，共同作用的結(jié)果。并且AS的病理改變也是一種慢性炎癥性反應(yīng)［1-2］，涉及多種炎性細(xì)胞因子、自由基、生長因子、黏附分子等一系列活性分子，而ox-LDL在AS發(fā)生早期是最重要的致病因子［3］。來源于山葡萄籽提取物中的白藜蘆醇具有廣泛的藥理活性作用，有報道其四聚體山葡萄素A(vitisin A)和 7′′′-8′′′-二脫氫山葡萄素 A(7′′′-8′′′-didehydro-vitisin A)，具有一定的心、腦血管保護作用［4］，但對其抗AS作用研究仍較少，分子機制尚不明確。本研究采用ox-LDL和LPS損傷，擬從體外角度通過檢測損傷后內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活力，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量和SOD活性、活性氧和NO產(chǎn)生，巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子釋放，單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞黏附等涉及AS發(fā)生早期的多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，探討其抗動脈粥樣硬化可能涉及的分子機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與主要試劑 Hoescht 33258，Invitrogen;佛波酯(phorbomyristateacetate，PMA)、脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、四氮唑藍(lán)(nitroblue tetrazolium，MTT)，2′-7′-二氯熒光素雙醋酸鹽(2′，7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)，Sigma 公司;ox-LDL，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所;一氧化氮，MDA，SOD測定試劑盒，南京建成生物工程研究所;乳酸脫氫酶測定試劑盒，北京北化康泰臨床試劑有限公司;鼠源 IL-1β、TNFa酶聯(lián)免疫測定試劑盒，eBioscience公司，USA;人源IL-1β酶聯(lián)免疫測定試劑盒，武漢博士德;DMEM高糖、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清，Gibco。

1.2 主要儀器和設(shè)備 Spectra Max M5酶標(biāo)儀，Molecular Devices，USA;熒光倒置顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)。

1.3 細(xì)胞 單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞THP-1，人內(nèi)皮細(xì)胞Hy926細(xì)胞株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院國家藥物篩選中心保存;鼠巨噬細(xì)胞RAM246.7細(xì)胞株，人正常肝細(xì)胞株L02購自上海細(xì)胞所。

1.4 溶液配制

1.4.1 待測化合物配置 山葡萄素A和二脫氫山葡萄素A［5-6］(以下簡稱為vsA和ddh-vsA)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所天然藥物化學(xué)室林茂老師提供，將二者均用DMSO配置成10 mmol·L-1儲存液，工作液從終濃度100 μmol·L-1始3倍稀釋8個濃度。

1.4.2 熒光染料DCFH-DA的配制 熒光染料DCFH-DA配置成10 mmol·L-1的 DMSO儲液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液使終濃度為20 μmol·L-1。

1.4.3 熒光染料Hoescht33258的配制 熒光染料Hoescht 33258用無菌培養(yǎng)液配成10 mmol·L-1儲液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液使終濃度為1 μmol·L-1使用。

1.5 實驗方法

1.5.1 酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定巨噬細(xì)胞IL-1β(或TNF-α)的分泌 在24孔板中，每孔含有約2.0×108·L-1鼠巨噬細(xì)胞或經(jīng)160 nmol·L-1PMA誘導(dǎo)分化48 h的THP-1巨噬細(xì)胞，加入陽性對照藥物TO901317和待測藥物，同時設(shè)置空白對照孔，預(yù)孵育30 min，加入脂多糖LPS(終濃度為1 mg·L-1)，孵育24 h，取上清100 μl，檢測采用ELISA試劑盒進行。

1.5.2 一氧化氮含量測定 THP-1細(xì)胞按照2×104的細(xì)胞數(shù)加入48孔板，PMA誘導(dǎo)分化，待細(xì)胞貼壁后，分為空白組、ox-LDL組(ox-LDL終濃度100 mg·L-1)、ox-LDL+樣品組，各組設(shè)置4個復(fù)孔，處理24 h取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清100 μl，按照測試盒操作說明檢測NO的濃度。

1.5.3 ox-LDL致細(xì)胞損傷后MTT法和乳酸脫氫酶(LDH)法細(xì)胞活力測定 將培養(yǎng)好的Hy926細(xì)胞和PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞，以每孔約為5×103細(xì)胞數(shù)鋪96孔板，加入不同稀釋濃度的測試樣品孵育30 min后，再加入 ox-LDL，分別孵育 12、24、48 h后，加入 100 μl MTT，按文獻方法［7］進行 MTT 細(xì)胞活力測定或取細(xì)胞上清按照北京北化康泰試劑盒方法測定乳酸脫氫酶活性。

1.5.4 MDA和SOD的測定 將24孔培養(yǎng)的細(xì)胞分為空白組和樣品處理組，加入樣品后預(yù)孵育30 min，加入ox-LDL培養(yǎng)2 d，收集細(xì)胞。細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，Lowry法蛋白定量，分別按照試劑盒操作說明測定細(xì)胞中的MDA含量和SOD活性。

1.5.5 細(xì)胞活性氧的熒光檢測方法 將培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分為空白組、陽性對照組和樣品處理組，先加入樣品預(yù)孵育30 min后，加入ox-LDL處理培養(yǎng)2 d后，用20 μmol·L-1活性氧特異熒光探針 DCFHDA處理30 min。通過Spectra Max M5酶標(biāo)儀檢測熒光強度評價細(xì)胞內(nèi)ROS水平(Ex=485 nm，Em=530 nm)。

1.5.6 單核細(xì)胞THP-1和內(nèi)皮細(xì)胞Hy926黏附實驗［8-9］將長至對數(shù)生長期的Hy926細(xì)胞以5×108·L-1接種于96孔板，待細(xì)胞融合80% ～100%，加入含ox-LDL的培養(yǎng)基(含2%BSA，0.5%FBS)，作用24 h。另外，取對數(shù)生長期THP-1細(xì)胞，控制細(xì)胞濃度2～5×109·L-1，加入終濃度為10 mg·L-1細(xì)胞核特異熒光染料Hoechst 33258，避光，培養(yǎng)30 min，無血清培養(yǎng)基洗后，1 000 r·min-1離心制備濃度為1×109·L-1的THP-1細(xì)胞懸液，加入已鋪好Hy926細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔50 μl。避光培養(yǎng)60 min。棄上清，加入PBS，輕輕振蕩，去除未黏附細(xì)胞。于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 研究用化合物結(jié)構(gòu) 見Fig 1A，1B。

Fig 1 Chemical Structure of two compoundsA:7?-8?-didehydro-vitisin A;B:vitisin A

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測4個化合物細(xì)胞毒結(jié)果 檢測化合物vsA和ddh-vsA對Hy926、PMA誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞和RAW264.7的細(xì)胞毒作用，結(jié)果顯示除化合物vsA對RAW264.7細(xì)胞在100 μmol·L-1顯示輕微細(xì)胞毒作用外，其余均未顯示明顯毒性作用(詳細(xì)結(jié)果和具體方法略)

2.2 化合物對ox-LDL致巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護作用 實驗結(jié)果如Fig 2～4顯示，ox-LDL可明顯導(dǎo)致人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞THP-1、鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7和內(nèi)皮細(xì)Hy926活力下降和LDH的釋放增加?；衔飗sA和ddh-vsA可明顯增加ox-LDL損傷后內(nèi)皮細(xì)胞活力(MTT還原法);并可明顯降低不同孵育時間下的LDH釋放并呈一定的濃度依賴關(guān)系。兩種方法檢測結(jié)果基本一致，提示兩個被測化合物均起到一定的內(nèi)皮細(xì)胞保護作用。

2.3 化合物對LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β分泌的影響 利用ELISA方法考察LPS刺激巨噬細(xì)胞后，活性化合物對TNF-α和IL-1β分泌水平的影響。結(jié)果如Fig 5，6所示，活性化合物對人和鼠巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β的分泌有非常好的抑制作用，并且呈很好的濃度依賴關(guān)系，表明化合物具有較好的抗炎作用。

2.4 化合物對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮產(chǎn)生的抑制作用 以ox-LDL為炎癥誘導(dǎo)因子，研究化合物對ox-LDL處理后的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO是否存在抑制作用。結(jié)果如Fig 7所示，化合物對巨噬細(xì)胞NO的產(chǎn)生具有較強的抑制作用，而且有很好的劑量依賴關(guān)系。

Fig 2 Effect of compounds on ox-LDL induced alternation of cell viability in Hy926(48 h，MTT assay) ± s，n=4)C:Control;O:ox-LDL treated model group;T:1 μmol· L-1 TO901317 treated.＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs ox-LDL

Fig 3 Effects of vsA(A)and ddh-vsA(B)on ox-LDL induced alteration of LDH release in Hy926(±s，n=4)T:1 μmol·L-1TO901317 treated，vsA and ddh-vsA:3，10，30 μmol·L-1treated.＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P＜0.01 vs ox-LDL treated

Fig 4 Effects of compounds on ox-LDL induced alteration of LDH release in mouse macrophage cell line RAW264.7(A)and PMA-induced human macrophage cell line THP-1(B)(±s，n=4)T:1 μmol·L-1TO901317 treated;vsA and ddh-vsA:3，10，30 μmol·L-1treated.＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P＜0.01 vs ox-LDL treated

Fig 5 The inhibitory effect of compounds on LPS-induced IL-1β secretion in mouse macrophage(±s，n=4)C:Control;T:1 μmol·L-1TO901317 treated;vsA and ddh-vsA:3，10，30 μmol·L-1treated. ＊＊P ＜ 0.01 vs control;#P ＜ 0.05，##P ＜0.01 vs LPS treated

Fig 6 The inhibitory effect of compounds on LPS induced TNF-α secretion in human macrophage THP-1(A)and mouse macrophage RAW264.7(B)(±s，n=4)C:Control;LPS:Model LPS treated T:1 μmol·L-1TO901317 treated;vsA and ddh-vsA:3，10，30 μmol·L-1treated.＊＊P ＜ 0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs LPS treated

2.5 化合物抑制細(xì)胞活性氧生成的作用 鑒于氧化應(yīng)激在動脈粥樣硬化中的關(guān)鍵作用，我們探討了化合物對ox-LDL處理的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中活性氧生成的影響。結(jié)果如Fig 8，9，活性化合物vsA和ddh-vsA均可降低ox-LDL致RAW264.7和Hy926細(xì)胞中活性氧的釋放，提示化合物具有抑制細(xì)胞ROS生成的作用，并具有一定的濃度依賴關(guān)系。

2.6 化合物抑制ox-LDL致MDA生成增加和誘導(dǎo)SOD表達(dá)的作用 本實驗通過檢測體外培養(yǎng)Hy926和RAW264.7中MDA的含量來反映化合物對脂質(zhì)過氧化損傷的影響，結(jié)果如Fig 10所示，活性化合物均可以減少Hy926細(xì)胞中MDA的含量，誘導(dǎo)SOD的表達(dá)，提示對過氧化脂質(zhì)產(chǎn)生的損傷可能有保護作用。

Fig 7 The inhibitory Effect of compounds on ox-LDL induced NO release in macrophage THP-1(24 h)(±s，n=4)C:Control;T:1 μmol·L-1TO901317 treated;vsA and ddh-vsA:3，10，30 μmol·L-1treated.＊＊P ＜ 0.01 vs control，#P ＜ 0.05，##P ＜0.01 vs ox-LDL treated

Fig 8 The inhibitory effect of compounds on ox-LDL induced ROS production in mouse RAW264.7(±s，n=4)C:Control;TO901317:0.1，1，10 μmol·L-1treated;vsA and ddhvsA:10，30 μmol·L-1treated;＊＊P ＜ 0.01 vs control，#P ＜ 0.05，##P＜0.01 vs ox-LDL treated

2.7 白藜蘆醇抑制單核巨噬細(xì)胞THP-1和內(nèi)皮細(xì)胞Hy926黏附 考察了化合物ddh-vsA對ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1和Hy926黏附的影響，結(jié)果如Fig 12所示，10 μmol·L-1化合物 ddh-vsA 具有抑制單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞黏附的作用。

3 討論

動脈粥樣硬化實質(zhì)也是一個包括炎性細(xì)胞激活和浸潤的慢性炎癥性疾?。?2］，涉及多種細(xì)胞因子、生長因子、氧、氮自由基和黏附分子等一系列活性分子。如在激活的巨噬細(xì)胞中通過核因子NF-κB(nuclear factor-κB)及活性蛋白-1(activation protein，AP-1)信號傳遞，造成IL-1β、IL-6及TNF-α等多種炎癥細(xì)胞因子大量分泌［12，13］。

Fig 9 The inhibitory effect of compounds on ox-LDL induced ROS production in human Hy926(±s，n=4)C:Control;T:1 μmol·L-1TO901317 treated;vsA and ddh-vsA;3，10，30 μmol·L-1treated.＊＊P ＜ 0.01 vs control;#P ＜ 0.05，##P ＜0.01 vs ox-LDL treated

Fig 10 The inhibitory effect of compounds on ox-LDL induced MDA production in Hy926(A)and RAW264.7(B) ± s，n=4)C:Control;T:1 μmol·L-1TO901317 treated;vsA and ddh-vsA:3，10，30 μmol·L-1treated.＊＊P ＜ 0.01 vs control;#P ＜ 0.05，##P ＜0.01 vs.ox-LDL treated.

Fig 11 The effect of compounds on increasing SOD activity in mouse macrophage RAW264.7(±s，n=4)C:Control;TO901317:0.1，1，10 μmol·L-1treated;vsA and ddhvsA:30，10，3 μmol·L-1treated;＊＊ P ＜ 0.01 vs control;#P ＜ 0.05，##P＜0.01 vs ox-LDL treated

Fig 12 The inhibitory effect of 10207 on ox-LDL induced adhesion of THP-1 monocytes to the human endothelial cell line Hy926A:Normal cell;B:ox-LDL 50 mg·L-1treated;C:10 μmol·L-1 ddh-vsA pretreated 30 min before ox-LDL treated

一氧化氮(NO)也是一種具有多種生理功能的小分子物質(zhì)，病理狀態(tài)下大量的NO與超氧陰離子結(jié)合形成危害性極大的氮氧自由基，促進AS早期炎癥性細(xì)胞和泡沫化細(xì)胞的形成［14］。

Ox-LDL具有明顯的致動脈粥樣硬化作用，影響AS病變發(fā)生和發(fā)展的多個過程［15］。如ox-LDL引發(fā)機體產(chǎn)生氧自由基，攻擊生物膜形成脂質(zhì)過氧化物，如醛類過氧化物丙二醛(MDA)，造成細(xì)胞代謝和功能障礙，進一步加重細(xì)胞損傷。因此檢測MDA含量可反映細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。

鑒于內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能改變是動脈粥樣硬化早期的標(biāo)志性病理事件，保護內(nèi)皮完整性對預(yù)防動脈粥樣硬化具有重要意義。ox-LDL在AS形成的早期起到類似于炎癥介質(zhì)的作用，可損傷血管內(nèi)皮，引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集;促進單核細(xì)胞向內(nèi)皮黏附并向內(nèi)皮下轉(zhuǎn)移;使內(nèi)皮細(xì)胞對LDL的通透性增高，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，甚至壞死［16-17］。

氧化應(yīng)激(oxidative stress)與動脈粥樣硬化的發(fā)病關(guān)系也極為密切。氧化應(yīng)激產(chǎn)生過量的氧自由基(oxygen free radical，OFR)或活性氧(ROS)造成細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集，是動脈粥樣硬化發(fā)生的一個重要促進因素［12-13］。而超氧歧化酶(SOD)是活性氧清除系統(tǒng)中發(fā)揮抗氧化作用的關(guān)鍵酶，在保護細(xì)胞免受氧化損傷過程中具有十分重要的作用［18］。

文獻報道，核受體LXRs激動劑，TO901317具有明確的早期保護動脈粥樣硬化的作用［19-20］，主要表現(xiàn)在保護內(nèi)皮細(xì)胞完整性、抑制巨噬細(xì)胞泡沫化、下調(diào)炎性相關(guān)基因，抑制炎性細(xì)胞因子和活性氧、氮自由基的表達(dá)，抑制黏附分子和單核趨化蛋白的表達(dá)，減輕炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞黏附等，本文將其作為陽性對照藥物。通過體外培養(yǎng)Hy926、RAM264.7和PMA誘導(dǎo)的THP-1三種細(xì)胞，加入損傷因素ox-LDL處理后，(1)采用了MTT法和LDH活性測定兩種方法來檢測細(xì)胞活力，評價了化合物對不同孵育時間下ox-LDL致細(xì)胞損傷的保護作用。實驗結(jié)果表明山葡萄素A和二脫氫山葡萄素A對ox-LDL導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞損傷有較明顯的保護作用;(2)通過檢測說明山葡萄素A和二脫氫山葡萄素A可抗氧化，減少氧、氮自由基產(chǎn)生，抑制LPS所致的巨噬細(xì)胞炎性因子釋放，抑制ox-LDL導(dǎo)致的單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞黏附。因此，從體外實驗充分證明了山葡萄素A和二脫氫山葡萄素A對以上AS發(fā)生早期事件的多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)均有作用，對解釋其抗As的分子機制具有重要意義，提示其可能的As保護機制涉及多個靶點和通路的相互作用和調(diào)節(jié)。

細(xì)胞泡沫化途徑及關(guān)鍵調(diào)控因素，已成為防治AS的重要藥物作用靶點。我國地域遼闊，植物中蘊含豐富的心血管保護成分，提取和篩選其中抗AS有效成份［21］并闡明其機制，是我國藥學(xué)研究中一個有發(fā)展前途的研究方向。

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