殼寡糖抗小鼠腦缺血/再灌注作用研究

孫雅煊，劉 婷，戴雪伶，高兆蘭，魏 榮，鄭秋生，姜招峰

殼寡糖(chitooligosaccharides，COS)，系指由甲殼素或殼聚糖經(jīng)水解后產(chǎn)生的一類聚合度低且可溶于水的氨基糖類化合物，可被機(jī)體吸收利用。殼寡糖不僅具有甲殼素和殼聚糖相似的性質(zhì)，而且一些生理活性或功能更為明顯，甚至顯示出甲殼素和殼聚糖所不具備的生理活性［1］。

國內(nèi)外研究表明，殼寡糖具有抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗感染等多種藥理作用。雖已有多位學(xué)者證實［2－10］殼寡糖的神經(jīng)保護(hù)活性，但絕大部分實驗僅局限于細(xì)胞水平，很少有研究者在整體水平探討其活性。殼寡糖能通過血腦屏障［11］，而且腦缺血后血腦屏障的通透性增加［12］，故我們推測殼寡糖能有效地進(jìn)入大腦，治療腦血管疾病。

本研究采用線栓法建立小鼠大腦中動脈栓塞模型，旨在驗證灌胃給予殼寡糖是否具有抗腦缺血/再灌注損傷作用，并探討其可能機(jī)制，為將殼寡糖開發(fā)成神經(jīng)保護(hù)劑提供整體水平的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 ♂ ICR小鼠，體質(zhì)量25～28 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號:SCXK(京)2007-001。自然光照周期飼養(yǎng)，術(shù)前12 h禁食，自由飲水。

1.1.2 藥品及試劑 殼寡糖(純度≥90%，平均分子質(zhì)量1 500，脫乙酰度≥90%):北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院;紅四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC):北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司;丙二醛(MDA)、羰基、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽－過氧化物酶(GSH-Px)、考馬斯亮蘭試劑盒:南京建成生物工程研究所;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 實驗儀器 水浴鍋:北京市長風(fēng)儀器儀表公司;多功能酶標(biāo)儀:Sigma公司;TGL 16M離心機(jī):湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司;渦旋混合器:金壇市醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥 將小鼠隨機(jī)分為6組，即假手術(shù)組、模型組、依達(dá)拉奉(3 mg·kg－1，陽性對照藥)組及殼寡糖高、中、低劑量(200、100、50 mg·kg－1)組。藥物用前溶于蒸餾水，按照10 ml·kg－1體質(zhì)量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d，末次給藥后1 h制備腦缺血/再灌注模型。

1.2.2 局灶性腦缺血/再灌注模型的制備［13－15］采用線栓法制備小鼠左側(cè)大腦中動脈栓塞模型。用4%水合氯醛(400 mg·kg－1)腹腔注射，麻醉小鼠，頸部皮膚去毛消毒后作正中切口，分離出左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈，在頸總動脈上開一小口，將一頭端用硅橡膠包裹的直徑為0.11 mm的魚線沿頸總動脈，經(jīng)頸內(nèi)動脈向顱內(nèi)插至大腦中動脈分叉處，插入深度約12～13 mm，結(jié)扎頸內(nèi)動脈和頸總動脈，固定魚線，縫合皮膚。缺血2 h后將魚線拉出至頸內(nèi)外動脈分叉處，即實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組僅分離頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，但不插入魚線。小鼠蘇醒后出現(xiàn)手術(shù)對側(cè)肢體運動障礙即為模型制備成功。

1.2.3 神經(jīng)功能缺陷評分 參照Longa的5分制評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評分。0分:正常，無神經(jīng)損傷癥狀;l分:不能完全伸展對側(cè)前爪;2分:提尾后向外側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時向?qū)?cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走或意識喪失。

1.2.4 腦梗死面積測定 缺血2 h再灌22 h后，迅速將小鼠斷頭，取出完整前腦，冠狀切成1.5 mm厚的腦片，于0.5%TTC溶液中37℃水浴孵育15 min。然后置于10%的中性甲醛溶液中固定。對每腦片正反兩面進(jìn)行掃描，用圖像分析軟件Photoshop 6.0求出梗死區(qū)和非梗死區(qū)面積。

1.2.5 生化指標(biāo)測定 小鼠斷頭取腦，去除嗅腦、腦干、小腦后將大腦分別置于勻漿器中，用冰生理鹽水按質(zhì)量與體積比為1∶9的比例冰浴下制備成體積分?jǐn)?shù)為10%的腦組織勻漿，立即放入－20℃冰箱中保存。按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書測定腦組織中MDA、羰基含量、SOD、CAT及GSH-Px活性。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS13.0 For Windows統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 殼寡糖對腦缺血/再灌注小鼠神經(jīng)功能缺陷評分和腦梗死面積的影響 從Fig 1及Fig 2可以得知，腦缺血/再灌注后，模型組和給藥組小鼠顯現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能缺陷癥狀、腦組織梗死。殼寡糖呈劑量依賴性地降低神經(jīng)功能缺陷評分和腦梗死面積，尤其是殼寡糖高、中劑量(200、100 mg·kg－1)組與模型組差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)。

2.2 殼寡糖對腦缺血/再灌注小鼠MDA和羰基含量的影響 Fig 3和Fig 4中數(shù)據(jù)顯示腦缺血/再灌注后，模型組MDA和羰基含量明顯增多，與假手術(shù)組比較差異有顯著性(P＜0.01)，表明腦組織遭受嚴(yán)重的氧化損傷。殼寡糖高、中劑量組的MDA和羰基含量減少，與模型組相比差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)。

Fig 1 Effect of chitooligosaccharides on neurological deficit scores in mice subjected to cerebral ischemia/reperfusion(±s，n=9)＊＊P ＜0.01 vs model group.

Fig 2 Effect of chitooligosaccharides on brain infarct size in mice subjected to cerebral ischemia/reperfusion(±s，n=9)*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

Fig 3 Effect of chitooligosaccharides on MDA content in mice subjected to cerebral ischemia/reperfusion(±s，n=9)＊＊P ＜0.01 vs model group.

2.3 殼寡糖對腦缺血/再灌注小鼠抗氧化物酶活性的影響 Tab 1中結(jié)果顯示，模型組小鼠腦組織中SOD、CAT及GSH-Px活性低于假手術(shù)組，說明缺血/再灌注引起自由基過度增加，消耗更多的抗氧化物酶。殼寡糖高劑量(200 mg·kg－1)組與模型組比較，3種抗氧化物酶活性均增加，差異有顯著性(P＜0.01)。殼聚糖各劑量組與模型組相比較，3種抗氧化物酶活性呈劑量依賴性的上升。

Fig 4 Effect of chitooligosaccharides on carbonyl content in mice subjected to cerebral ischemia/reperfusion±s，n=9)*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

Tab 1 Effect of chitooligosaccharides on antioxidant enzyme activities in mice subjected to cerebral ischemia/reperfusion± s，n=9)

Tab 1 Effect of chitooligosaccharides on antioxidant enzyme activities in mice subjected to cerebral ischemia/reperfusion± s，n=9)

*P ＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group.

Group Dose/mg·kg－1 SOD/U·mg－1Pro CAT/U·mg－1Pro GSH-Px/U·mg－1Pro Model / 59.66 ±6.42 6.09 ±0.54 690.19 ±80.06 Sham / 81.66 ±3.88＊＊ 8.33 ±0.44＊＊ 1047.76±49.61＊＊Chitooligosaccharides 200 76.25±6.57＊＊ 7.28±0.70＊＊ 893.39±99.09＊＊Chitooligosaccharides 100 70.72 ±8.97* 6.53 ±0.49 797.07 ±88.87*Chitooligosaccharides 50 62.67 ±8.74 6.25 ±0.63 712.71 ±58.06 Edaravone 3 78.52±5.03＊＊ 7.65±0.57＊＊ 910.62±57.66＊＊

3 討論

腦血管疾病是人類三大死亡原因之一，嚴(yán)重危害人類的健康［16］。近年來，糖類物質(zhì)被證實具有治療腦血管疾病作用［17］。殼寡糖是天然糖中唯一大量存在的堿性氨基寡糖，水溶性好，安全無毒，容易被機(jī)體吸收，很有可能在抗腦缺血/再灌注損傷中有出色的表現(xiàn)［18］。本研究通過建立的小鼠局灶性腦缺血/再灌注模型，首先觀察到殼寡糖高、中劑量(200、100 mg·kg－1)組明顯改善小鼠神經(jīng)功能缺陷，降低腦梗死面積，與模型組差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)。驗證了殼寡糖能有效地通過血藥屏障，發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。

腦缺血/再灌注可引起腦內(nèi)氧化應(yīng)激，造成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物大分子氧化損傷。本研究結(jié)果顯示殼寡糖高、中劑量(200、100 mg·kg－1)組可降低腦缺血/再灌注小鼠腦組織中氧化產(chǎn)物MDA和羰基的含量，與模型組相比差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)，原因可歸于以下幾點。

殼寡糖能有效地清除腦組織內(nèi)的羥自由基、超氧陰離子及過氧化氫等自由基，一是因為殼寡糖能提供正電子與自由基反應(yīng)，將自由基轉(zhuǎn)化為更為穩(wěn)定的產(chǎn)物，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng);二是由于殼寡糖形成分子內(nèi)氫鍵能力較弱，羥基和氨基容易被激活，有利于清除自由基［19－21］。

腦缺血過程中，局部腦組織金屬離子沉積引起活性氧生成增多［22］。由于殼寡糖分子中羥基、氨基及酰氨基等基團(tuán)的存在，它可以依靠氫鍵或鹽堿形成具有類似網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的籠形分子，從而能有效地螯合金屬離子，抑制金屬離子催化自由基的生成［23］。徐魏等［11］就曾報道殼寡糖能螯合Cu等過渡態(tài)金屬離子，并能清除人體自由基。此外，本實驗數(shù)據(jù)表明，與模型組相比，殼寡糖高劑量(200 mg·kg－1)組可明顯提高腦缺血/再灌注小鼠腦組織內(nèi)SOD、CAT和GSH-Px活性(P＜0.01)。這3種抗氧化酶作為體內(nèi)第一道抗氧化防御系統(tǒng)，其活性的上調(diào)可催化更多的自由基轉(zhuǎn)化為非毒性物質(zhì)。

綜上所述，殼寡糖對腦缺血/再灌注損傷具有拮抗作用，與其抗氧化活性有關(guān)。

本實驗僅在體內(nèi)初步證實了殼寡糖能減輕腦缺血所致氧化損傷，至于殼寡糖如何通過血腦屏障，殼寡糖在腦內(nèi)的分布以及篩選合適分子量的殼寡糖等工作，還有待進(jìn)一步開展。

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