地錦草有效部位抗真菌作用及其機制研究

安惠霞，古力娜·達吾提，李治建，斯拉甫·艾白，

地錦草，維吾爾藥名為夏塔熱其尼(Xiahatereqini)，為大戟科植物地錦Euphorbia humifusa Willd.或斑地錦Euphorbia maculata L.的干燥全草，是中醫(yī)、維吾爾醫(yī)常用藥材，臨床主要用于治療手癬、體癬、足癬、花斑癬、銀屑?。?］。紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)是引起皮膚真菌的主要病原菌，占皮膚癬菌病感染的69.5%，可致手癬、足癬、頭癬等，所致癬菌病病程持久，難治愈，易復(fù)發(fā)［2］。采用透射電鏡觀察地錦草有效部位對紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)的影響，高效液相色譜法研究地錦草有效部位對真菌細胞膜麥角甾醇生物合成的影響，以研究其抗真菌作用的機制。從天然藥物中有效地提取、篩選抗真菌活性部位及其成分，尋找安全性好、抗菌譜廣、療效高的抗真菌藥物已成為一個重要的研究方向，并具有廣闊的應(yīng)用開發(fā)前景［3-5］。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 地錦草藥材由新疆維吾爾醫(yī)藥研究所藥劑室提供，經(jīng)生藥學(xué)鑒定為大戟科植物地錦草Euphorbia humifusa Willd。藥材醇提取后采用大孔吸附樹脂法洗脫得到6個部位，課題組參照美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)推薦的《產(chǎn)孢絲狀真菌的液基稀釋法抗真菌藥物敏感性試驗方案》(M38-A)［6］，對6個不同部位的抗真菌敏感性進行篩選，得出其中部位6的體外抗真菌活性最為明顯，對紅色毛癬菌的MIC達到149 mg·L-1，定位有效部位。有效部位參照中國藥典一部(附錄ⅤA)進行含量測定，總黃酮含量為34 mg·g-1。

特比奈芬(TERB)，純度99.82%，上海誠優(yōu)有限公司提供，批號為:20090101。

1.2 試驗菌株與培養(yǎng)基 紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)，菌種編號:XYZ T.r 40013，由新疆醫(yī)科大學(xué)真菌與真菌病研究中心菌種保藏庫(XYZ)提供，均經(jīng)過常規(guī)的真菌學(xué)鑒定，在PDA培養(yǎng)基上4℃保存?zhèn)溆?。RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司);三氮嗎啡啉丙磺酸(MOPS，Amresco公司);

1.3 透射電鏡觀察地錦草有效部位對紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)的影響 參照NCCLS推薦的M38-A方案［6］，將地錦草有效部位(實驗濃度為64 mg·L-1)和紅色毛癬菌菌接種液分別以1∶1的比例稀釋到終濃度，26℃孵育7 d后，PBS漂洗，體積分數(shù)為3的戊二醛固定，體積分數(shù)為1的鋨酸固定，系列濃度乙醇脫水，丙酮+乙醇脫水，包埋劑包埋，烘烤聚合，超薄切片，染色，日立H-600型透射電鏡(TEM)觀察。

1.4 高效液相色譜法(HPLC)研究地錦草有效部位對紅色毛癬菌麥角甾醇生物合成的影響 藥物干預(yù)菌絲操作同電鏡樣品的制備。挑取各孔菌絲，PBS(pH=7.4)洗滌，精密稱取各組濕菌0.1 g，置于50 ml圓底燒瓶中，加皂化劑(0.1 g·ml-1KOH的甲醇溶液)15 ml，混勻，80℃水浴皂化90 min。加石油醚(沸程30℃ ～60℃)15 ml提取3次，合并提取液置于60 ml分液漏斗中，加水15 ml洗滌，醚層于60℃水浴揮干，得未皂化脂(nonsaponifiable lipids，NSLs)［7］，未皂化脂用甲醇溶解，定容至 5 ml，0.45 μm微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜法(HPLC)測定濾液中麥角甾醇含量。

HPLC色譜條件:色譜柱 Waters symmetry shieldTMRP(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，柱溫30℃;流動相:甲醇;檢測波長:282 nm;流速:1.0 ml·min-1;進樣量:20 μl。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 麥角甾醇含量測定結(jié)果采用Student′s t-test檢驗，結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡觀察地錦草有效部位對紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)的影響 未經(jīng)藥物處理的紅色毛癬菌透射電鏡下觀察，菌絲切面的細胞壁完整、厚薄均勻、質(zhì)地致密;細胞基質(zhì)均勻，密度較大，細胞器豐富，胞質(zhì)內(nèi)清晰可見細胞核、線粒體、脂滴等(Fig 1A)。

地錦草有效部位作用后，紅色毛癬菌的透射電鏡觀察:當以64 mg·L-1濃度作用后，細胞壁剝脫、破裂，細胞膜皺縮、破裂，細胞外表面有明顯高電子致密顆粒聚集，細胞腫脹明顯，在細胞內(nèi)可見較多的泡狀結(jié)構(gòu)，已無完整的細胞器結(jié)構(gòu)(Fig 1B)。

Fig 1 SEM results of active component of Euphorbia humifusa and TERB against Trichophyton rubrum.TEM(A，50 000 ×)results of Control Trichophyton rubrum;Active component of Euphorbia humifusa(B，64 mg·L-1，50 000 × );TEM results of active component of Euphorbia humifusa and TRBF(C，0.005 mg·L-1，35 000×)

2.2 HPLC研究地錦草有效部位對紅色毛癬菌麥角甾醇生物合成的影響

2.2.1 方法學(xué) 將麥角甾醇標準品準確配制成0.93 ～29.75 mg·L-16 個濃度的溶液，進樣 20 μl，以色譜峰面積為縱坐標，進樣濃度為橫坐標進行回歸，回歸方程為:^Y=39004 X+2422.3，r=0.9998。精密度和穩(wěn)定性良好，麥角甾醇的平均回收率均大于93%，RSD小于3%。

2.2.2 高效液相色譜圖(Fig 2)

2.3 麥角甾醇含量測定 由Tab 1可知，不同濃度地錦草有效部位處理后，紅色毛癬菌中麥角甾醇含量與其生長對照菌相比，含量明顯降低，差異存在顯著性(P＜0.01)，并且有明顯的劑量依賴性。

Fig 2 Effect of active component of Euphorbia humifusa on ergosterol biosynthesis of Trichophyton rubrum

Tab 1 Contents of ergosterol in the Trichophyton rubrum mycelium in the groups treated with active component of Euphorbia humifusa of different doses and TERB(±s，n=3)

Tab 1 Contents of ergosterol in the Trichophyton rubrum mycelium in the groups treated with active component of Euphorbia humifusa of different doses and TERB(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control group;△△P＜0.01 vs low dose group;##P＜0.01 vs middle dose group

Group Dose/mg·L-1 Ergosterol concentration in NSLs/mg·L -1 Growth control 0 34.84±0.02 Low dose 32 23.42±0.00＊＊Middle dose 64 10.04±0.02＊＊△△High dose 128 5.06±0.05＊＊△△##Positive control 0.0025 15.81±0.04＊＊

3 討論

麥角甾醇是真菌細胞膜的重要組分［8］，它在確保膜結(jié)構(gòu)的完整性，與膜結(jié)合酶的活性，膜的流動性，細胞活力及物質(zhì)運輸?shù)确矫嫫鹬匾饔?，一旦麥角甾醇缺乏，必將引起真菌細胞膜功能異常，甚至發(fā)生細胞破裂［9］。麥角甾醇生物合成途徑中的幾個關(guān)鍵酶是抗真菌藥物的作用靶位，對其生物合成的研究將為抗真菌藥物的篩選及其作用機制的研究提供重要的理論基礎(chǔ)［8，10-13］。

地錦草是中醫(yī)、維吾爾醫(yī)常用藥材，應(yīng)用廣泛。維吾爾醫(yī)理論認為，地錦草具有清除異常粘液質(zhì)、膽汁液及敗血、消腫止癢之功能，維吾爾醫(yī)常用其復(fù)方百癬夏塔熱治療手癬、體癬、足癬、花斑癬、銀屑病等疾病。本課題組參照 NCCLS推薦的 M38-A方案［6］，篩選出對臨床常見的真菌具有很強的抗菌作用的有效部位。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，地錦草有效部位作用后真菌細胞壁、細胞膜出現(xiàn)多處破裂，胞內(nèi)細胞器損傷嚴重;HPLC結(jié)果說明地錦草有效部位主要作用于紅色毛癬菌細胞膜麥角甾醇合成通路，抑制麥角甾醇的生物合成，從而使真菌細胞膜破壞，通透性增加，內(nèi)容物外泄，發(fā)揮其抗真菌作用。本研究用中藥化學(xué)提取分離手段與藥理實驗密切結(jié)合，方法快速、簡單，結(jié)果可靠，初步完成了地錦草有效部位的篩選，為進一步研究其抗真菌作用機制和分離有效的先導(dǎo)化合物奠定基礎(chǔ)。

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