白花丹醌對(duì)瘦素誘導(dǎo)人肝星狀細(xì)胞增殖與α-SMA表達(dá)的影響

劉雪梅，韋燕飛，彭 岳，謝海源，方 卓，段雪琳，趙鐵建

近年來(lái)研究證實(shí)，白花丹(Plumbago zeylanica L.)具有控制和逆轉(zhuǎn)乙型肝炎，肝硬化，以及控制某些晚期惡性腫瘤等方面的作用［1］，白花丹以及白花丹醌對(duì)EMT-6乳腺癌和S180肉瘤有一定的抑制作用［2］。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明［3］，白花丹對(duì)化學(xué)性肝損害動(dòng)物模型有一定的保護(hù)作用，并能抑制HSC增殖。白花丹醌是植物白花丹的主要活性成分，具有很強(qiáng)的活血化瘀作用，據(jù)測(cè)定白花丹根中的白花丹醌的含量多少與其活血化瘀功效的強(qiáng)弱相一致，此外白花丹醌具有抗腫瘤、抗炎、抗細(xì)菌、抗真菌等多種作用。本實(shí)驗(yàn)以人肝星狀細(xì)胞株(HSC-LX2)為研究對(duì)象，用MTT法檢測(cè)白花丹醌對(duì)HSC-LX2增殖的影響;以 α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)作為測(cè)定HSC活化的指標(biāo)，采用熒光定量PCR檢測(cè)白花丹醌對(duì)HSC-LX2α-SMA基因的表達(dá)和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HSC-LX2α-SMA蛋白表達(dá)情況，探討白花丹醌抗肝纖維化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源 人肝星狀細(xì)胞株(HSC-LX2)，由上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所徐列明教授饋贈(zèng)。

1.2 藥物及主要試劑 白花丹醌(Sigma公司，批號(hào):20071028);重組 leptin(protech公司，批號(hào):8110060R);SYBR Premix Ex TaqTM，寶生物工程(大連)有限公司;DMEM(Gibico，Cat№12800-056);胎牛血清(Hyclone，批號(hào):NTM0136);TRIzol(Invitrogen);MTT(Sigma公司，lot№3564B04);秋水仙堿(西雙版納藥業(yè)公司，批號(hào):070205);α-SMA一抗(北京中杉生物有限公司，批號(hào):20080323)。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo，Model 311);高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，TGL-16G-A);相差倒置顯微鏡(德國(guó)Zeiss，XD-101型);酶標(biāo)儀(美國(guó) Thermo，Model 450);多通道 PCR儀(美國(guó)MJ公司，PTC-220);核酸蛋白測(cè)定儀(日本島津);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司，iCycler iQ)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝星狀細(xì)胞株(HSC-LX2)，置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，當(dāng)細(xì)胞呈單層致密狀時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，每3～4 d傳代一次，按1∶2傳代，每次試驗(yàn)均在呈指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞中進(jìn)行。

1.4.2 細(xì)胞分組及處理 空白對(duì)照組:加入含100 ml·L-1胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液;leptin對(duì)照組:在含100 ml·L-1胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中加 leptin 1 000 μg· L-1，終濃度為 100 μg·L-1;leptin與藥物不同質(zhì)量濃度聯(lián)用組，秋水仙堿組:leptin加秋水仙堿，終濃度為6.25 mg·L-1;藥物組:在leptin刺激組基礎(chǔ)上加入白花丹醌，低、中、高劑量組終濃度分別為 2 、8 、16 μmol·L-1。

1.4.3 MTT法測(cè)定白花丹醌對(duì)細(xì)胞增殖的影響將細(xì)胞以5×107個(gè)·L-1接種于96孔板，分為leptin 對(duì)照組、白花丹醌2 、8 、16 μmol·L-1濃度組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，24 h后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，換含各藥物的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，各孔加入MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸出全部液體，加入 200 μl DMSO，微量振蕩器上振蕩5 min，于酶標(biāo)儀雙波長(zhǎng)(570 nm，630 nm)比色，抑制率/%=(對(duì)照孔-給藥孔)/對(duì)照孔×100%。

1.4.4 熒光定量PCR法檢測(cè)α-SMA mRNA的表達(dá) ① 將細(xì)胞以5×107個(gè)·L-1接種于50 ml培養(yǎng)瓶中，每組3瓶，24 h后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，換含各藥物的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。② 采用TRIzol法抽提細(xì)胞中總RNA。用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA含量及純度，A260/A280均在1.8～2.0之間。③ 取cDNA 5 μg，采用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank查找基因序列并自行設(shè)計(jì)引物，以β-actin為內(nèi)參，引物序列α-SMA:FP:5′-CGTGGCTACTCCTTCGTG-3′， RP:5′-TGATGACCTGCCCGTCT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為 160 bp;β-actin:FP:5′-ACACTGTGCCCATCTACG-3′，RP:5′-TGTCACGCACGATTTCC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為153 bp。④反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s;56℃退火，20 s;72℃延伸30 s。共反應(yīng)55個(gè)循環(huán)。⑤反應(yīng)結(jié)束后分析每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的PCR產(chǎn)物進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期起始點(diǎn)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(thrshold cycle，Ct)，以 β-actin為參照物，參考文獻(xiàn)［4］計(jì)算出各組mRNA相對(duì)表達(dá)情況。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)HSC-LX2α-SMA的表達(dá) 將傳代培養(yǎng)的HSC-LX2用含10%胎牛血清的DMEM接種于放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，24 h后待細(xì)胞貼壁伸展后，分組、干預(yù)同前。藥物與細(xì)胞共孵育24h后取出蓋玻片置于載玻片上，用4%多聚甲醛固定，3%H2O2過(guò)氧化氫滅活，抗原修復(fù)，血清封閉后，依次滴加α-SMA一抗、二抗試劑孵育后進(jìn)行脫水、封片，鏡下觀察。采用HPIAS2000型多媒體彩色圖像分析系統(tǒng)對(duì)染色陽(yáng)性部位進(jìn)行平均灰度值的測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 白花丹醌對(duì)HSC-LX2細(xì)胞增殖的影響 白花丹醌呈劑量依賴性抑制瘦素誘導(dǎo)HSC-LX2增殖，以16 μmol·L-1濃度時(shí)最為明顯，與 leptin對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.01)，見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Effects of Plumbagin on proliferation of HSC-LX2±s，n=6)

Tab 1 Effects of Plumbagin on proliferation of HSC-LX2±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs leptin control group

Group OD Inhibition/%leptin control 0.914±0.089 -leptin+Plumbagin 2 μmol·L-1 0.655 ±0.072 28.4 leptin+Plumbagin 8 μmol·L-1 0.286 ±0.070＊＊ 68.7 leptin+Plumbagin 16μmol·L-1 0.046 ±0.014＊＊95.0

2.2 白花丹醌對(duì)HSC-LX2細(xì)胞α-SMA mRNA表達(dá)的影響 采用2-△△CT方法的公式進(jìn)行計(jì)算，得到相對(duì)于leptin對(duì)照組α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示:空白對(duì)照組有一定量α-SMA mRNA表達(dá)，leptin對(duì)照組leptin作用24 h，α-SMA mRNA強(qiáng)表達(dá)，leptin對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05);而經(jīng)白花丹醌和秋水仙堿作用24 h后，活化的HSC-LX2內(nèi)α-SMA mRNA含量較leptin對(duì)照組均下降(P＜0.05或P＜0.01)，以白花丹醌16、8 μmol·L-1組和秋水仙堿組尤為明顯(P ＜0.01)。見(jiàn)Tab 2和Fig 1～3。

Tab 2 Effects of Plumbagin on relative quantification of α-SMA mRNA expression of HSC-LX2±s，n=4)

Tab 2 Effects of Plumbagin on relative quantification of α-SMA mRNA expression of HSC-LX2±s，n=4)

▲P＜0.05 vs blank control group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs leptin control group

Group Relative quantification Blank control 0.709±0.166 leptin control 1.000±0.000▲leptin+colchicine 0.579±0.083＊＊leptin+Plumbagin 2 μmol·L-1 0.703 ±0.125*leptin+Plumbagin 8 μmol·L-1 0.580 ±0.092＊＊leptin+Plumbagin 16 μmol·L-1 0.487 ±0.127＊＊

Fig 1 The standard line of FQ-PCR of α-SMA positive standard

Fig 2 Amplification curve of α-SMA in flurogenic quantitative polymerase chain reaction

Fig 3 Melting curve of α-SMA in flurogenic quantitative polymerase chain reaction

2.3 白花丹醌對(duì)HSC-LX2細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果:α-SMA蛋白陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物為細(xì)胞質(zhì)棕黃色細(xì)顆粒狀染色。與空白組比較(0.09±0.01，F(xiàn)ig 4A)，leptin能明顯增強(qiáng) α-SMA 蛋白的表達(dá)(0.158±0.02，F(xiàn)ig 4B)，各藥物組能抑制HSC-LX2細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)，表達(dá)的面積縮小，顏色從棕黃色變?yōu)闇\黃色，低、中、高劑量組α-SMA蛋白表達(dá)水平分別為0.123±0.02、0.109±0.02、0.103±0.01(Fig 4C～E)，與leptin對(duì)照組比較差異有顯著性，P＜0.01。

Fig 4 Expression of α-SMA was detected by immunohistochemical staining in HSC-LX2 (×20)A:Blank control group;B:Leptin control group;C:Low dose group;D:Middle dose group;E:High dose group

3 討論

HSC在肝纖維化過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用［5］，在致病因子刺激下，HSC被激活，轉(zhuǎn)化為肌纖維樣細(xì)胞，并表達(dá) α-SMA，繼而使肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)生成增加而降解減少，最終導(dǎo)致肝臟膠原沉積與纖維化［6］。隨著肝纖維化細(xì)胞分子生物學(xué)機(jī)制的進(jìn)一步明確，以HSC為靶標(biāo)的治療措施逐漸成為抗肝纖維化的重要方法，如抑制HSC活化和增殖，調(diào)節(jié)膠原合成和降解等［7］。

最近研究［8］顯示，瘦素具有促進(jìn)HSC活化和增殖作用，瘦素對(duì)HSC作用同血小板源性生長(zhǎng)因子一樣是較強(qiáng)的有絲分裂原。研究表明［9］，在慢性肝損傷發(fā)生時(shí)，各種始發(fā)的致病因素觸發(fā)HSC活化并大量表達(dá)瘦素，其后瘦素通過(guò)自分泌和旁分泌兩條途徑作用于OB-Rb，激活其JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞等表達(dá)α-SMA，并在其介導(dǎo)下進(jìn)一步誘導(dǎo)HSC的增殖、活化，進(jìn)而促進(jìn)膠原等ECM的合成和分泌，最終促進(jìn)了肝纖維化的發(fā)生。激活的HSC再大量增生、胞體增大、Vit A脂滴消失、膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多、表達(dá)更多具有收縮功能的 α-SMA。因此 α-SMA的表達(dá)已被認(rèn)為是HSC激活的顯著特征之一，成為肝纖維化的一個(gè)重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

以往研究表明，白花丹醌具有抑制炎癥、降低肝組織中膠原含量，減少肝纖維化相關(guān)因子表達(dá)等抗肝纖維化作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在白花丹醌中高劑量組作用24 h后，HSC-LX2細(xì)胞中α-SMA mRNA的水平明顯降低(P＜0.01);各藥物組HSC-LX2細(xì)胞中α-SMA蛋白表達(dá)面積縮小，顏色從棕黃色變?yōu)闇\黃色，與leptin對(duì)照組比較差異有顯著性，P＜0.01。這說(shuō)明該藥可明顯抑制重組 leptin誘導(dǎo)HSC-LX2中α-SMA基因和蛋白的表達(dá)，提示白花丹醌抗肝纖維化的作用可能與其抑制HSC的活化及功能有關(guān):一方面，直接抑制HSC的增殖，降低其活力;另一方面，通過(guò)抑制HSC的功能，降低α-SMA的分泌量及表達(dá)水平，從而降低肝臟的纖維化程度及其誘導(dǎo)HSC增殖活化的能力。因此，根據(jù)以上結(jié)果和結(jié)合白花丹體內(nèi)抗肝纖維化作用的研究結(jié)果，說(shuō)明白花丹醌抗肝纖維化作用機(jī)制之一是從mRNA水平和蛋白水平抑制α-SMA表達(dá)，發(fā)揮抗肝纖維化作用。

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