姜黃素對(duì)Saos-2細(xì)胞增殖和凋亡的影響

吳燕峰，梁新軍，郭 宇，夏 侃，夏仁云，沈慧勇

骨肉瘤是最常見(jiàn)的骨的原發(fā)性惡性腫瘤，好發(fā)于青少年，對(duì)化療和放療等傳統(tǒng)治療方法敏感性低，預(yù)后較差，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，5年生存率低［1］。為此，發(fā)現(xiàn)并建立新的、有效的骨肉瘤的防治措施勢(shì)在必行。

姜黃素(Curcuma)是一種從植物根莖中提取的多酚類(lèi)化合物，主要具有抗氧化、抗炎及抗腫瘤等多種生物學(xué)功能［2］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究表明［3－5］，姜黃素在體外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，但其機(jī)制尚不十分明確。本實(shí)驗(yàn)探討了姜黃素對(duì)人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的影響并檢測(cè)了其對(duì)凋亡相關(guān)基因Fas表達(dá)的調(diào)控，為進(jìn)一步明確姜黃素的抗腫瘤機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 DMEM培養(yǎng)基、新鮮小牛血清為Gibco公司產(chǎn)品;姜黃素購(gòu)自美國(guó) Sigma公司，用DMSO溶解配制成0.01 mol·L－1的儲(chǔ)存液分裝備用，使用時(shí)用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋到所需濃度，DMSO的含量小于0.1%;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、胰酶均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;Fas兔抗人多克隆抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2培養(yǎng)于含10%新鮮小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Saos-2細(xì)胞，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1×104接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培育，使細(xì)胞增殖至鋪滿每孔底部。實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組和姜黃素作用組(5、10、20、40 μmol·L－1)，每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔。分別在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24、48、72 h后，每孔加入20 μl MTT(5 g·L－1)，繼續(xù)在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。吸盡上清，再加入DMSO 150 μl，振蕩10 min，使其充分溶解，在96 孔酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)490 nm的吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。計(jì)算公式為:細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率/%=(比色對(duì)照組吸光度平均值－實(shí)驗(yàn)組吸光度平均值)/比色對(duì)照組吸光度平均值×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Saos-2細(xì)胞分別接種于6孔板中，分組同上，每組作用48 h，各組重復(fù)3次。胰酶消化，收集1×106細(xì)胞，1 000 r·min－1離心5 min，棄上清。用70%乙醇1 ml固定。離心，棄上清。PBS洗2遍。加入適量Annexin V-FITC和PI，避光染色0.5 h。上機(jī)檢測(cè)，分析 5 ～40 μmol·L－1細(xì)胞凋亡率。

1.5 Hoechst 33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Saos-2細(xì)胞接種于6孔板，行細(xì)胞爬片，采用經(jīng)MTT和流式檢測(cè)作用最明顯的20 μmol·L－1姜黃素作用，含等體積DMSO的DMEM培養(yǎng)基作為對(duì)照。收集作用后48 h的細(xì)胞，PBS洗2次，用75%的乙醇4℃固定5 min，PBS沖洗，Hoechst 33258染色10 min后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.6 Western blot分析細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)的變化收集不同濃度姜黃素作用48 h后的Saos-2細(xì)胞約1×107，提取其胞質(zhì)蛋白;取50 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，5%封閉液室溫封閉2～4 h后，用含0.05%Tween-20的TBS緩沖液(TBST)漂洗3次，每次10 min，加入相應(yīng)的兔抗人Fas多克隆抗體(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3次，每次10 min，再加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗(1∶500)，37℃搖床溫育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖抑制作用 不同濃度姜黃素對(duì)Saos-2細(xì)胞的生長(zhǎng)有不同程度的抑制，濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越明顯，光學(xué)顯微鏡下，姜黃素作用后的Saos-2細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落;部分細(xì)胞體積縮小，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少。當(dāng)姜黃素濃度為20 μmol·L－1時(shí)抑制作用明顯增強(qiáng)，與對(duì)照組相比，差異有顯著性(P＜0.05)。見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 The proliferation inhibition of Saos-2 cells induced by curcumaThe inhibition rate rised significantly when the concentration of curcuma was over 20 μmol·L－1，*P ＜0.05 vs control

2.2 姜黃素誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡 Annexin V/PI雙染檢測(cè)可區(qū)分壞死與凋亡的細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)我們使用此方法檢測(cè)顯示不同濃度姜黃素可以誘導(dǎo)Saos-2細(xì)胞凋亡。當(dāng)姜黃素濃度為20 μmol·L－1時(shí)，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P ＜0.05)，濃度為 40 μmol·L－1時(shí)，凋亡率與control組比較明顯升高，但與姜黃素20μmol·L－1組比較差異無(wú)顯著性(P ＞0.05)。見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 The apoptosis of human osteosarcoma cells Saos-2 induced by curcuma was detected by flow cytometryThe effect rised significantly when the concentration of curcuma was over 20 μmol·L －1.*P ＜0.05 vs control

2.3 Hoechst 33258熒光染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)20 μmol·L－1姜黃素作用后，Saos-2細(xì)胞胞核出現(xiàn)核固縮、碎裂，產(chǎn)生凋亡小體，如Fig 3所示。

Fig 3 The morphological alteration after treated with curcuma was confirmed by Hoechst 33258 stainingA:Control;B:Treated with 20 μmol·L －1curcuma

2.4 姜黃素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)姜黃素作用前后骨肉瘤細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)變化，顯示Fas在人骨肉瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)，姜黃素處理細(xì)胞48 h后，骨肉瘤細(xì)胞的Fas蛋白表達(dá)強(qiáng)度較前增高，且其作用隨姜黃素濃度增高而明顯(Fig 4)。

Fig 4 The protein expression of Fas after treated with curcuma

3 討論

骨肉瘤為最常見(jiàn)的嚴(yán)重危害青少年健康的惡性腫瘤之一。盡管近年來(lái)臨床治療取得了很大進(jìn)展，但死亡率和致殘率仍然很高。如何延緩其生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步提高其治療效果仍是骨肉瘤治療的難題之一［6］。尋找具有高抗腫瘤活性的新型藥物是目前骨肉瘤的研究熱點(diǎn)之一。

姜黃素是一種多酚類(lèi)物質(zhì)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有潛在的抗腫瘤作用而得到廣泛的關(guān)注。目前認(rèn)為姜黃素主要通過(guò)(1)抑制腫瘤血管生成;(2)上調(diào)caspases蛋白酶誘導(dǎo)凋亡;(3)抑制核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá);(4)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯;(5)調(diào)節(jié)凋亡抑制基因的表達(dá)等多種機(jī)制起到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而對(duì)腫瘤起到治療作用［3～5］。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用不同濃度的姜黃素體外作用于人骨肉瘤系Saos-2，通過(guò)MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn)，不同濃度姜黃素可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，且其抑制率與姜黃素的濃度和作用時(shí)間有關(guān)，當(dāng)姜黃素濃度為20 μmol·L－1，作用時(shí)間48 h時(shí)抑制作用明顯增強(qiáng)，與對(duì)照組相比，差異有顯著性(P＜0.05，見(jiàn)Fig 1)。與國(guó)外其他學(xué)者研究結(jié)果相似［7］，提示姜黃素可以體外抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，對(duì)骨肉瘤細(xì)胞起到殺傷作用。

目前認(rèn)為，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞監(jiān)測(cè)系統(tǒng)重要的組成部分。在細(xì)胞凋亡的早期細(xì)胞膜表面的磷脂酰絲氨酸(PS)從膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到膜外，Annexin V可與PS結(jié)合，而在早期凋亡階段細(xì)胞胞膜是完整的，PI不能通過(guò)胞膜，只有在細(xì)胞壞死時(shí)才可進(jìn)入胞內(nèi)與胞核中的核酸結(jié)合發(fā)出熒光。因此Annexin V和PI雙染可作為凋亡檢測(cè)的有力手段［8］。我們的流式結(jié)果顯示，姜黃素可體外誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞Saos-2發(fā)生凋亡，且其凋亡率隨著姜黃素濃度的增加而增加。Hoechst 33258可透過(guò)細(xì)胞膜并對(duì)DNA染色而發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，常用來(lái)進(jìn)行凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)檢測(cè)。我們通過(guò)熒光顯微鏡下觀察顯示20 μmol·L－1的姜黃素可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞核胞核固縮、碎裂，出現(xiàn)凋亡小體。這些結(jié)果都說(shuō)明，姜黃素可以誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。

研究表明，腫瘤壞死因子(TNF)超家族的成員Fas與其天然配體(Fa sL)或相應(yīng)單克隆抗體相結(jié)合，通過(guò)激活胱冬酶(Caspase)家族等過(guò)程完成細(xì)胞凋亡信號(hào)傳遞，是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一［9］。我們通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Fas蛋白在人骨肉瘤細(xì)胞Saos-2中呈低表達(dá)，而經(jīng)過(guò)姜黃素作用后，F(xiàn)as蛋白與對(duì)照組相比明顯增強(qiáng)，提示姜黃素通過(guò)上調(diào)Fas的表達(dá)，增加骨肉瘤細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)的敏感性，重新啟動(dòng)了腫瘤細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加速腫瘤細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到腫瘤治療的目的。

綜上所述，姜黃素可以抑制骨肉瘤細(xì)胞Saos-2增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，作用機(jī)制涉及上調(diào)Fas蛋白表達(dá)，可能啟動(dòng)了細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)過(guò)程有關(guān)。

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