SHP2抑制劑NSC-87877對(duì)炎性疼痛的抑制作用及其機(jī)制

楊鴻斌，楊 嫻，曹 靜，李 帥，劉燕妮，索占偉，鄭城容，崔鴻斌，郭 忠，胡曉東

(1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院分子藥理研究所，蘭州 730000;2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院急救中心，蘭州 730030;3.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，蘭州 730030)

外周組織損傷引起的炎性病理性疼痛是常見(jiàn)病、多發(fā)病，目前臨床上常用的鎮(zhèn)痛藥物對(duì)此類(lèi)疼痛的療效較差或無(wú)效。近年來(lái)的研究認(rèn)為［1］:脊髓背角NMDA型谷氨酸受體在病理性疼痛的形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。NMDA受體是由2個(gè)NR1亞基和2個(gè)NR2A亞基(簡(jiǎn)稱(chēng)NR2AR)或2個(gè)NR2B亞基(簡(jiǎn)稱(chēng)NR2BR)組成的異構(gòu)型受體。深入探討參與慢性疼痛的NMDA受體亞型，發(fā)現(xiàn)特異性阻斷NR2BR，對(duì)炎性疼痛能夠產(chǎn)生強(qiáng)大的抑制作用［1］，提示NR2BR的功能異?？哼M(jìn)，可能是導(dǎo)致病理性疼痛的關(guān)鍵因素。

我們的前期研究顯示［2］:伴隨著炎性疼痛的形成，脊髓突觸NR2BR的表達(dá)水平會(huì)明顯升高，這可能是誘發(fā)NR2BR功能亢進(jìn)的重要途徑。值得注意的是:NR2BR的突觸表達(dá)，受到一系列蛋白酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶的調(diào)節(jié)［3，4］。干預(yù)這些酪氨酸激酶/磷酸酶的作用、以降低NR2BR的突觸表達(dá)，可能具有潛在的鎮(zhèn)痛價(jià)值。

SHP2(src homology-2 domain-containing phosphatase 2)是一種重要的蛋白酪氨酸磷酸酶［5-7］，廣泛參與細(xì)胞凋亡、白血病等生理、病理過(guò)程。本研究首次探討了SHP2在脊髓背角的分布，并深入研究了SHP2抑制劑NSC-87877［8］對(duì)炎性疼痛的影響及其與調(diào)節(jié)NR2B突觸表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 8-Hydroxy-7-［(6-sulfo-2-naphthyl)azo］-5-quinolinesulfonic acid disodium salt(NSC-87877;Tocric Bioscience;USA);完全佛氏佐劑(Sigma);抗NR2B、NR2A的特異性抗體(Millipore Corporation，Temecula，CA，USA);抗 SHP2 抗體(武漢博士德);辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Baltimore，PA，USA);ECL 發(fā)光試劑盒(江蘇碧云天)。

1.2 方法

1.2.1 疼痛模型制備 昆明種小鼠(♂，18～22 g)，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。左后足底皮下注射20 μl CFA;對(duì)照組注射等容量生理鹽水。

1.2.2 行為學(xué)測(cè)試 在模型制備前、后，通過(guò)Up-Down法［2］測(cè)定 Von Frey纖維誘發(fā)的縮足閾值(PWT)。

1.2.3 鞘內(nèi)給藥 為減少損傷，我們沒(méi)有采用鞘內(nèi)置管的方法［9］，而是將一根 25 μl微量注射器，于L5-L6椎骨間隙直接經(jīng)皮穿刺，以進(jìn)針產(chǎn)生空洞感、或動(dòng)物輕微甩尾作為針尖進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔的標(biāo)志［10］，緩慢推注藥物 5 μl;對(duì)照組給予等容量生理鹽水。

1.2.4 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分離 動(dòng)物用苯巴比妥鈉(30 mg·kg-1，ip)麻醉，錐形板切開(kāi)術(shù)，分離 L4-L5節(jié)段脊髓背角，在RIPA細(xì)胞裂解緩沖液中勻漿［2］，用于總蛋白的測(cè)定。上述組織勻漿，通過(guò)梯度離心，提取富含突觸后致密質(zhì)(PSD)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)［2］，方法為:勻漿液(homogenates;H)1 000×g離心10 min，收集上清液(S1)，棄去沉淀(P1);S1繼續(xù)10 000×g離心15 min，收集富含突觸小體(crude synaptosomal fractions)的沉淀P2，棄去上清(S2);P2在含有0.5%Triton X-100的細(xì)胞裂解緩沖液中孵育15 min，32 000×g離心20 min，最后棄去上清(S3)，收集富含PSD的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)P3。以上所有操作均在4℃進(jìn)行。

1.2.5 免疫印跡 50 μg蛋白上樣;8%SDSPAGE電泳分離蛋白、并印跡于PVDF膜;5%脫脂牛奶封閉1 h，用相應(yīng)蛋白的特異性抗體4℃孵育過(guò)夜;洗滌;HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h;ECL發(fā)光試劑盒顯像;利用Image J軟件進(jìn)行圖像統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 SHP2在脊髓背角中的分布 免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示:SHP2存在于脊髓背角(Fig 1A);而且在突觸小體(P2)、突觸后致密質(zhì)(P3)等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中都能夠檢測(cè)到SHP2(Fig 1A)，提示SHP2可能參與脊髓痛覺(jué)信息的突觸傳遞。

2.2 SHP2對(duì)CFA誘發(fā)的痛覺(jué)超敏的影響 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組:① 對(duì)照組:左后足底皮下注射生理鹽水，6 h后鞘內(nèi)給予5 μl的生理鹽水;② CFA組:左后足底皮下注射CFA，6 h后鞘內(nèi)給予5 μl的生理鹽水;③ NSC-87877治療組(0.3 μg):左后足底皮下注射CFA，6 h后鞘內(nèi)給予5 μl的 NSC-87877(0.3 μg);④ NSC-87877 治療組(3 μg):左后足底皮下注射CFA，6 h后鞘內(nèi)給予5 μl的 NSC-87877(3 μg)。結(jié)果顯示:和對(duì)照組動(dòng)物比較，CFA組動(dòng)物的縮足閾值明顯降低，說(shuō)明痛覺(jué)超敏的形成;而和CFA組動(dòng)物比較，3 μg NSC-87877治療組動(dòng)物的縮足閾值明顯升高，且作用可維持至少25 min，而0.3 μg NSC-87877對(duì)縮足閾值不產(chǎn)生影響，提示:3 μg的NSC-87877能夠明顯緩解炎性疼痛癥狀(Fig 1B)。而在正常動(dòng)物，鞘內(nèi)給予3 μg NSC-87877后25 min，動(dòng)物的縮足閾值和生理鹽水注射組比較無(wú)改變(saline vs 3 μg NSC-87877:(3.60 ±0.64)g vs(3.32 ±1.31)g，n=5，P ＞0.05)。

2.3 SHP2對(duì)脊髓背角NMDA受體表達(dá)的影響

2.3.1 SHP2抑制劑對(duì)總蛋白含量的影響 上述實(shí)驗(yàn)，在行為學(xué)測(cè)試后，立即分離脊髓背角，通過(guò)免疫印跡法，檢測(cè)全細(xì)胞中NMDA受體NR2B、NR2A亞基的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CFA組、NSC-87877治療組(3 μg)動(dòng)物和生理鹽水組比較，NR2B、NR2A的總蛋白含量無(wú)差異(數(shù)據(jù)未顯示)，提示NSC-87877不是通過(guò)調(diào)節(jié)NMDA受體的轉(zhuǎn)錄或翻譯過(guò)程而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

Fig 1 The distribution of SHP2 in the spinal dorsal horn and its role in inflammatory pain ±s)

2.3.2 SHP2抑制劑對(duì)突觸NMDA受體表達(dá)水平的影響 另一實(shí)驗(yàn)，在行為學(xué)測(cè)試后，分離脊髓背角，提取富含PSD的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，以免疫印跡法檢測(cè)PSD中NMDA受體的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)和生理鹽水對(duì)照組動(dòng)物比較，CFA組動(dòng)物NR2B亞基的突觸含量升高(Fig 2A)，而NR2A的突觸含量卻沒(méi)有變化(Fig 2B)，提示NR2B在突觸中的異常表達(dá)，可能參與痛覺(jué)超敏的形成。而和 CFA組動(dòng)物比較，3 μg的NSC-87877能夠降低NR2B的突觸含量 (Fig 2A)，同樣，NSC-87877對(duì)NR2A沒(méi)有明顯影響(Fig 2B)，提示特異性降低NR2B在突觸中的表達(dá)，可能是NSC-87877發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的重要機(jī)制。

3 討論

NR2B受體及其突觸輸送(synaptic trafficking)，參與學(xué)習(xí)與記憶等一系列生理、病理性過(guò)程［11］。目前發(fā)現(xiàn):在NR2B亞基胞質(zhì)C-末端的第1 472位，包含一個(gè)關(guān)鍵性的酪氨酸殘基(NR2B-Y1472)［4］。Src家族酪氨酸激酶(SFKs)對(duì)NR2B-Y1472的磷酸化，被認(rèn)為是決定NR2B突觸含量的核心因素［4］。另一方面，NR2B-Y1472的磷酸化還與酪氨酸磷酸酶(PTPs)有關(guān)［12］;SFKs和 PTPs之間的功能平衡，可能共同維持NR2B的突觸表達(dá)及其介導(dǎo)的突觸傳遞。

SHP2一種非受體型酪氨酸磷酸酶［5］。SHP2的功能異常，可能是導(dǎo)致奴南氏綜合征、白血病等的重要原因［5，8］。NSC-87877 是目前發(fā)現(xiàn)的為數(shù)不多的幾種SHP2化學(xué)抑制劑之一［8］，它能夠與SHP2的催化結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，對(duì)SHP2的半數(shù)抑制濃度為0.318 μmol·L-1，強(qiáng)于對(duì)其他磷酸酶如 PTP1B、HePTP等的作用，但較高濃度的NSC-87877在離體條件下對(duì)SHP1也有交叉抑制。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):鞘內(nèi)注射低劑量的NSC-87877，能夠明顯緩解炎性疼痛，提示:① SHP2可能參與脊髓痛覺(jué)信息的調(diào)控;② SHP2的激活對(duì)誘發(fā)痛覺(jué)超敏至關(guān)重要;③SHP2的化學(xué)抑制劑具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。

Fig 2 SHP2 inhibitor NSC-87877(NSC;3 μg)abolished the increase in NR2B synaptic expression induced by CFA

由于NSC-87877在緩解炎性疼痛的同時(shí)，能夠特異性降低NR2B的突觸表達(dá)，提示干擾NR2B的突觸輸送過(guò)程，可能是NSC-87877鎮(zhèn)痛的重要機(jī)制。鑒于NR2B-Y1472的磷酸化在調(diào)節(jié)NR2B突觸表達(dá)中的核心作用、以及SHP2和SFKs之間的密切關(guān)系［6］，我們推測(cè) NSC-87877的可能作用途徑在于:①直接去磷酸化NR2B-Y1472;② 通過(guò)抑制SFKs的活性，間接阻斷SFKs對(duì)NR2B-Y1472的磷酸化，從而下調(diào)NR2B的突觸含量。但NSC-87877的具體鎮(zhèn)痛機(jī)制還需要進(jìn)一步的深入研究。

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