熒光標(biāo)記的葉酸修飾殼聚糖納米載體研制

金鑫，張陽(yáng)德，王吉偉，張麗華，楊璞, 張旭，胡玉，于麗

(中南大學(xué) 衛(wèi)生部肝膽腸外科研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410008)

腫瘤作為威脅人類(lèi)健康的重大疾病，已引起人們的高度關(guān)注，各種抗腫瘤藥物和療法層出不窮，但抗腫瘤藥物往往選擇性不高，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也可能殺死機(jī)體正常細(xì)胞，毒副作用大，給患者帶來(lái)極大的痛苦。所以，如何提高抗腫瘤藥物的靶向性和安全性成為腫瘤治療的迫切問(wèn)題。葉酸受體[1]靶向是近年來(lái)一種備受關(guān)注的新型抗腫瘤機(jī)制，而葉酸對(duì)葉酸受體具有高度的親和性，所以，可利用這一特性將葉酸作為抗腫瘤藥物的靶向配體，利用葉酸受體在某些腫瘤部位的過(guò)度表達(dá)而在正常組織低水平表達(dá)的特性實(shí)現(xiàn)葉酸偶聯(lián)藥物的靶向輸送[2?3]。而偶聯(lián)載體以大分子物質(zhì)為主，有利于延長(zhǎng)體內(nèi)保留時(shí)間，提高療效。殼聚糖[4]是一種價(jià)廉易得、便于修飾、無(wú)毒、生物相容性好并兼有一定抗腫瘤活性的生物大分子，廣泛用于藥物治療載體。此外，殼聚糖近來(lái)被廣泛應(yīng)用到制藥工藝中的納米技術(shù)可進(jìn)一步提高藥物的穩(wěn)定性，并實(shí)現(xiàn)緩釋和控釋給藥。所以，可利用葉酸靶向性和殼聚糖緩釋和控釋給藥的特點(diǎn)，選擇殼聚糖為基質(zhì)來(lái)制備葉酸靶向納米載體，并用異硫氰基熒光素[5]做熒光標(biāo)記，為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)作準(zhǔn)備[6?7]。

1 儀器與試劑

儀器為：AUW120D電子天平(島津，日本)；79?1磁力加熱攪拌器(江蘇省金壇市正基儀器有限公司)；真空冷凍干燥機(jī)(LABCONCO，美國(guó))；TGL16M高速冷凍離心機(jī)(英泰有限公司，長(zhǎng)沙)；TENSOR27傅里葉紅外光譜儀(BRUKER，德國(guó))；1000HSA激光粒度分析儀(馬爾文，英國(guó))；MFP?3D 原子力顯微鏡(ASYLUM RESEARCH，美國(guó))；LB2熒光倒置顯微鏡(LEICA，德國(guó))。

試劑為：殼聚糖(上海伯奧生物科技有限公司，脫乙酰度＞90%)；多聚磷酸鈉(TPP，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；SePHadexG-50葡聚糖凝膠(國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)；二甲基亞砜(DMSO，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，J&K Chemical Ltd)；葉酸(FA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；其余試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 葉酸活性酯的制備

稱(chēng)取2.6 g葉酸，溶于50 mL無(wú)水二甲亞砜(DMSO)中，再加入2.38 g二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和1.35 g N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)及1.25 mL三乙胺，于30 ℃反應(yīng)，過(guò)夜，過(guò)濾除去反應(yīng)副產(chǎn)物二環(huán)己基脲，減壓蒸餾除去部分溶劑，在攪拌中逐滴滴入含30%丙酮的無(wú)水乙醚溶液中，得到黃色沉淀物。然后，用無(wú)水乙醚洗滌數(shù)遍后于真空干燥，得到葉酸活性酯[8]，于室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 葉酸偶聯(lián)殼聚糖的制備及紅外光譜分析

稱(chēng)取殼聚糖160 mg，溶于40 mL醋酸?醋酸鈉緩沖液(pH 4.6)中，在磁力攪拌條件下以2 mL/min的速度緩慢加入 8 mL葉酸活性酯的 DMSO溶液(20 mg/mL)，于30 ℃反應(yīng)12 h，然后，用10 moL/L NaOH調(diào)pH值至9，離心，用蒸餾水洗滌數(shù)遍后，重新溶于2%醋酸水溶液，得到葉酸偶聯(lián)殼聚糖溶液[9]。

取葉酸活性酯、殼聚糖和葉酸偶聯(lián)殼聚糖適量，采用紅外光譜儀檢測(cè)偶聯(lián)情況。

2.3 熒光標(biāo)記的葉酸?殼聚糖納米粒的制備

稱(chēng)取10 mg異硫氰酸熒光素(FITC)，溶于10 mL無(wú)水乙醇中，在磁力攪拌條件下逐滴加入到20 mL葉酸?殼聚糖的醋酸溶液中，避光反應(yīng)4 h，使FITC上的碳原子與殼聚糖上的氨基反應(yīng)以便進(jìn)行標(biāo)記[10]。用10 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH值至9。離心，用蒸餾水洗滌，直至濾液澄清呈無(wú)色為止。將沉淀重新用 2%醋酸溶液溶解，用10 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH值至5，在磁力攪拌條件下逐滴加入10 mL TPP溶液(2 g/L)。反應(yīng)20 min后得到熒光標(biāo)記的葉酸?殼聚糖納米粒[11]。

2.4 葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒的形態(tài)觀(guān)察

取適量葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米?；鞈乙旱渭佑谠颇钙?，用原子力顯微鏡觀(guān)察其形態(tài)，用激光粒度分析儀測(cè)定納米粒的粒徑。

2.5 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

取肝癌 HepG2細(xì)胞，在含有 10%的小牛血清的1640培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為：5%(體積分?jǐn)?shù))CO2，37 ℃。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后在培養(yǎng)皿中的蓋玻片上接種，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

待培養(yǎng)皿中的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，吸去培養(yǎng)基。用PBS清洗3次。加入熒光標(biāo)記的葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒懸浮液和殼聚糖納米粒懸浮液，于37 ℃培養(yǎng)24 h，用PBS沖洗細(xì)胞3次，用小鑷子取出蓋玻片，放在預(yù)先洗凈的載玻片上，用抗萃滅劑封片，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察。

3 結(jié)果與討論

3.1 葉酸?殼聚糖納米粒的制備

將配體連接到微粒藥物載體上的方法，原則上取決于偶聯(lián)是在載體組裝前還是在組裝后進(jìn)行。在載體組裝完成后連接配體，將合適的活性功能基團(tuán)連接于載體某一成分的末端?；钚怨δ芑鶊F(tuán)必須與載體的組裝相適應(yīng)，并且可以有效地和配體連接。這一策略適用于大配體如單克隆抗體的連接。在載體自組裝前將配體連接到載體上相對(duì)容易，但這種方法的缺點(diǎn)是在載體的最終組裝完成后，一部分結(jié)合的配體會(huì)被包入微粒的內(nèi)部，從而不能與受體結(jié)合。采用離子交聯(lián)反應(yīng)法可制備葉酸?殼聚糖納米粒，即利用多聚磷酸鈉(TPP)對(duì)葉酸?殼聚糖進(jìn)行離子誘導(dǎo)凝膠化，可在一定條件下制備出葉酸?殼聚糖納米藥物載體。室溫下，在攪拌過(guò)程中，將pH值為7～9的TPP溶液加入到pH值為 4～6的葉酸?殼聚糖醋酸溶液中，通過(guò)帶負(fù)電的磷酸根離子與殼聚糖分子鏈上帶正電的質(zhì)子化氨基發(fā)生分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)凝膠化，可迅速形成納米粒子[12]。

3.2 紅外光譜分析

采用紅外光譜儀分析葉酸與殼聚糖的偶聯(lián)情況。圖1～3所示分別為殼聚糖、葉酸活性脂和葉酸偶聯(lián)殼聚糖的紅外光譜。從葉酸偶聯(lián)殼聚糖的紅外光譜可以看出(圖3)：—NH2在 1 640 cm?1處的吸收峰(見(jiàn)圖1)和—COOH在1 692 cm?1處的吸收峰(見(jiàn)圖2)消失，在1 562 cm?1處出現(xiàn)了新的強(qiáng)吸收峰，說(shuō)明殼聚糖上的氨基與葉酸上的羧基形成了酰胺鍵[13]，兩者成功偶聯(lián)。

圖1 殼聚糖的紅外光譜Fig.1 Infrared spectra of chitosan

圖2 葉酸活性酯的紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of folic acid

3.3 納米粒的粒徑和表面形態(tài)

圖4所示為熒光標(biāo)記的葉酸?殼聚糖納米粒的粒徑曲線(xiàn)。可見(jiàn)：熒光標(biāo)記的葉酸?殼聚糖納米粒的顆粒粒徑比較集中，無(wú)顆粒團(tuán)聚現(xiàn)象，平均粒徑約為290 nm。熒光標(biāo)記的葉酸?殼聚糖納米粒的原子力顯微鏡掃描像見(jiàn)圖5。可見(jiàn)：其顆粒形態(tài)規(guī)則，顆粒大小比較均勻，無(wú)顆粒團(tuán)聚現(xiàn)象[14]。

3.4 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用倒置熒光顯微鏡觀(guān)察葉酸?殼聚糖納米載體、殼聚糖納米粒與表達(dá)有葉酸受體的細(xì)胞之間的相互作用，結(jié)果見(jiàn)圖6和圖7?？梢园l(fā)現(xiàn)：細(xì)胞熒光效果明顯，且熒光強(qiáng)度與納米粒同細(xì)胞相互作用時(shí)間成正比。

圖3 葉酸偶聯(lián)殼聚糖的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of Folate-conjugated chitosan

圖4 熒光標(biāo)記的葉酸?殼聚糖納米粒的粒徑曲線(xiàn)Fig.4 Measurement of particle size map of Fluorimetrc Folate-coupled Chitosan nanoparticles

圖5 熒光標(biāo)記的葉酸?殼聚糖納米粒的原子力顯微鏡掃描像Fig.5 Atomic force microscope scanning image of fluorimetrc folate-coupled chitosan nanoparticles

圖6 熒光標(biāo)記的葉酸?殼聚糖納米粒與HepG2細(xì)胞相互作用的倒置熒光顯微鏡像Fig.6 Inverted fluorescence microscope images of fluorimetrc folate-coupled chitosan nanoparticles interaction with HepG2 cells

圖7 熒光標(biāo)記的殼聚糖納米粒與HepG2細(xì)胞相互作用的倒置熒光顯微鏡像Fig.7 Inverted fluorescence microscope image of fluorimetrc chitosan nanoparticles interaction with HepG2 cells

4 結(jié)論

(1) 殼聚糖上的 2個(gè)活性基團(tuán)可用于化學(xué)修飾：一個(gè)是脫去乙酞基的位點(diǎn)上的游離氨基，另一個(gè)是脫去乙酞基的位點(diǎn)上的羥基。

(2) 通過(guò)殼聚糖主鏈上的游離氨基與葉酸上的羧基形成酞胺鍵，達(dá)到殼聚糖化學(xué)修飾的目的。

(3) 由于殼聚糖的高分子特性，其水溶性差，只能在酸性水溶液中溶解，葉酸又無(wú)法溶于酸性水溶液，所以，采用先將殼聚糖與DMSO中的葉酸偶聯(lián)，后進(jìn)行熒光標(biāo)記及采用離子交聯(lián)反應(yīng)法制備納米粒的方法，制備了具有熒光標(biāo)記的葉酸殼聚糖納米粒，用異硫氰酸熒光素標(biāo)記殼聚糖和葉酸偶聯(lián)殼聚糖，以表面表達(dá)有葉酸受體的HepG2細(xì)胞為模型細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞攝取機(jī)理研究。

(4) 與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞熒光效果明顯，且熒光強(qiáng)度同納米粒與細(xì)胞相互作用時(shí)間成正比。

(5) 建立并完善了葉酸修飾殼聚糖納米載體的制備工藝，為后續(xù)靶向性納米制劑的研制提供了技術(shù)手段。

[1]Shia J, Klimstra D S, Nitzkorski J R, et al. Immunohistochemical expression of folate receptor a in colorectal carcinoma[J].Patterns and Biological Significance Human Pathology, 2008,39(4): 498?505.

[2]張良珂, 侯世祥, 毛聲俊. 葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒制備工藝研究[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志, 2004, 21(2): 255?258.ZHANG Liang-ke, HOU Shi-xiang, MAO Sheng-jun. Study on the preparation of folate-conjugated albumin nanoparticles[J].Journal of Biomedical Engineering, 2004, 21(2): 255?258.

[3]Lee R J, Low P S. Delvery of liposomes into cultured KB cells via folate receptor-mediated endocytosis[J]. Biol Chem, 1994,269(5): 3198?3199.

[4]WANG San-lang, LIN Hue-tin, LIANG Tzu-wen, et al.Reclamation of chitinous materials by bromelain for the preparation of antitumor and antifungal materials[J]. Bioresour Technol, 2008, 99(10): 4386?4393.

[5]譚光宏, 黃風(fēng)迎. FITC標(biāo)記葡聚糖粘附定量測(cè)定腫瘤組織血管密度[J]. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 13(5): 409?413.TANG Guang-hong, HUANG Feng-ying. Quantitative determination of relative tumor vascularity by FITC-dextran adsorption[J]. Journal of Hainan Medical College, 2007, 13(5):409?413.

[6]高曉寧, 唐鎖勤. 葉酸受體及其在介導(dǎo)藥物靶向腫瘤細(xì)胞治療中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2005, 13(5): 911?914.GAO Xiao-ning, TAN Suo-qing. Folate receptor and its application in the selective receptor-mediated targeting therapy of tumor cells—Review[J]. Journal of Experimental Hematology,2005, 13(5): 911?914.

[7]林鳳云, 朱照靜. 葉酸受體介導(dǎo)的靶向給藥研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2006, 26(10): 1281?1284.LIN Feng-yun, ZHU Zhao-jin. The progress of folate receptor in the selective receptor-mediated targeting therapy[J]. Chinese Journal of Hospital Pharmacy, 2006, 26(10): 1281?1284.

[8]Guo W J, George H, Hinkle, et al. 99mTc-HYNIC-Folate: a novel receptor-based targeted radiopharmaceutical for tumor imaging[J]. Nucl Med, 1999, 40(9): 1563?1569.

[9]薛昌剛, 童春義, 肖蘇堯. 諾氟沙星?殼聚糖微球的制備及釋藥性能[J]. 中南大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2008, 39(3): 480?485.XUE Chang-gang, TONG Chun-yi, XIAO Su-yao. Preparation of norfloxacin-chitosan microsphere and its drug release property[J]. Journal of Central South University: Science and Technology, 2008, 39(3): 480?485.

[10]任東文, 劉袖洞, 馬小軍. 熒光標(biāo)記殼聚糖的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究[J]. 功能材料, 2004, 35: 2463?2465.REN Dong-wen, LIU You-dong, MA Xiao-jun. A kinetics study of labeling reaction of chitosan with a fluorescent dye[J]. Journal of Funcyional of Materials Contents, 2004, 35: 2463?2465.

[11]蔣新宇, 周春山, 張俊山. 應(yīng)用三聚磷酸鈉為交聯(lián)劑制備載藥物納米粒的研究[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2003, 13(22):69?71.JIANG Xin-yu, ZHOU Chun-shan, ZHANG Jun-shan. Study on the preparation of nanoparticles using sodium tripolyphosphate as cross-linking agent[J]. China Journal of Modern Medicine,2003, 13(22): 69?71.

[12]Aronov O. Folate-targeted PEG as a potential carrier for Carboplatin analogs: Synthesis and in vitro studies[J].Bioconjugate Chemistry, 2003, 14(3): 563?574.

[13]蔣挺大. 甲殼素[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2004: 1?649.JIANG Ting-da. Chintin[M]. Beijing: Chemical Industry Press,2004: 1?649.

[14]張斌, 朱武. 偶聯(lián)改性納米 HAP/HDPE擠出復(fù)合生物材料的力學(xué)性能和微觀(guān)結(jié)構(gòu)[J]. 功能材料, 2007, 38(11): 1912?1915.ZHANG Bin, ZHU Wu. Mechanical properties and microstructure of nano HAP/HDPE extrusion bio-composite modified by silane-coupling agents[J]. Journal of Functional Materials, 2007, 38(11): 1912?1915.