中度嗜熱混合菌在攪拌槽中浸出黃銅礦及其群落動(dòng)態(tài)

周洪波，謝英劍，張汝兵，曾偉民，羅海浪，王玉光

(中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院，生物冶金教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙，410083)

生物冶金技術(shù)由于其具有反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境友好、能耗少、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于難處理金礦的生物氧化預(yù)處理和次生硫化銅礦的浸出[1]。黃銅礦作為最具有商業(yè)價(jià)值的硫化銅礦物之一，在世界上所知銅礦儲(chǔ)量中含量最大。隨著銅的需求量持續(xù)增加，研究黃銅礦的生物浸出具有重大意義。目前，采用常溫生物浸出黃銅礦的反應(yīng)速度緩慢，難以獲得較高的銅浸出速率和浸出率[1?2]。而中度嗜熱菌與常溫菌相比具有一定的優(yōu)勢(shì)。這是因?yàn)殡S著浸出的進(jìn)行，硫化礦物氧化以及微生物代謝產(chǎn)生大量的熱量，可以使整個(gè)浸出體系的溫度升高到50 ℃，局部溫度甚至可以達(dá)到75 ℃或者更高[3]，此時(shí)常溫菌通常已經(jīng)死亡或失去活性，而中度嗜熱菌在該溫度下可以保持較高的活性，可以快速浸出硫化礦，因此，在工業(yè)浸出黃銅礦中，與常溫菌相比，中度嗜熱菌具有一定的優(yōu)勢(shì)。槽浸是生物浸出工業(yè)應(yīng)用中常用的工藝之一，其浸出體系中傳質(zhì)效果好(如攪拌、通氣等)，可以較方便地對(duì)體系的主要工藝參數(shù)進(jìn)行控制，適合硫化礦物精礦的浸出[4]。浸礦工藝中有關(guān)微生物生態(tài)學(xué)的研究對(duì)于發(fā)展生物浸出技術(shù)具有重要的指導(dǎo)意義，只有了解浸礦體系中的生態(tài)結(jié)構(gòu)和主要微生物種群動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，才能通過(guò)浸礦工藝的調(diào)控，優(yōu)化浸礦微生物群落結(jié)構(gòu)，從而提高浸出速率[5]。Brierley認(rèn)為, 理解生物浸出中的微生物學(xué)過(guò)程尤其是微生物生態(tài)規(guī)律是提高工藝水平的關(guān)鍵[6]。PCR-RFLP(限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性)方法是一種非常成熟的基于 PCR的基因指紋圖譜技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于酸性礦坑水(AMD)中的微生物類群分析[7]，而對(duì)于生物浸出工藝中(如柱浸，槽浸等反應(yīng)體系中)浸礦微生物的種群動(dòng)態(tài)變化研究較少[8?9]。為此，本文作者采用 PCR-RFLP技術(shù)研究黃銅礦攪拌浸出過(guò)程中微生物群落變化動(dòng)態(tài)，并分析pH值、電位等參數(shù)的變化對(duì)微生物群落動(dòng)態(tài)變化的影響，以便為調(diào)控微生物種群結(jié)構(gòu)、優(yōu)化浸出工藝過(guò)程、提高浸出速率和浸出率提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 礦樣和菌種

實(shí)驗(yàn)所用黃銅礦精礦來(lái)自江西德興。礦石經(jīng)粉碎后過(guò)篩，粒徑≤75 μm。

經(jīng)X線衍射(XRD)分析，礦物主要由80%左右(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)黃銅礦、5%左右黃鐵礦、5%左右石英等成分組成。礦樣的元素分析結(jié)果為：32.02% Cu，22.65% S，30.90% Fe。礦物元素組成見(jiàn)表1。

表1 礦樣成分的能譜分析結(jié)果Table 1 Mineral sample composition by energy spectrum analysis

本實(shí)驗(yàn)所用菌種主要為Acidithiobacillus caldus，Leptospirillum ferriphilum，Sulfobacillus acidophilus和Sulfobacillus thermosulfidooxidans等中度嗜熱菌種的混合菌，純菌菌株均由教育部生物冶金重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離和保藏。其中：At. caldus為硫氧化細(xì)菌；L. ferriphilum為亞鐵氧化細(xì)菌；S. acidophilus和S. thermosulfidooxidans既能氧化硫又能氧化亞鐵。菌種的培養(yǎng)用9K基本鹽溶液加入10 g/L的黃銅礦精礦。培養(yǎng)條件如下：pH=1.8，溫度為45 ℃，轉(zhuǎn)速為170 r/min。9K基本鹽的成分為：(NH4)2SO43.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，KCl 0.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，Ca(NO3)20.01 g/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置及條件

浸礦實(shí)驗(yàn)是在1個(gè)總?cè)莘e為2.6 L的有機(jī)玻璃反應(yīng)器中進(jìn)行，內(nèi)徑為140 mm，高為170 mm，有1根通氣管沿槽壁豎直通向槽底，并且水平彎折。在水平通氣管的下面開(kāi)一排小孔，氣體從小孔中分散通入。用2個(gè)恒流泵加入H2SO4或者NaOH來(lái)調(diào)節(jié)初始pH值。pH值和電極電位Eh的測(cè)量值可以從微型電腦上直接讀取。實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置Fig.1 Experiment device

把反應(yīng)器裝入圓形玻璃恒溫水浴缸中，使反應(yīng)器內(nèi)浸出液恒定維持在45 ℃，實(shí)際裝液量為2 L(9K基本鹽培養(yǎng)基)，礦漿質(zhì)量濃度為10 g/L。菌種富集物以1.1×106個(gè)/mL的接種濃度被接入反應(yīng)器，浸出時(shí)間為30 d。反應(yīng)條件為：初始pH=2.0，溫度為45 ℃，攪拌漿轉(zhuǎn)速為500 r/min，通氣量為0.6 L/min。

1.3 儀器和試劑

實(shí)驗(yàn)儀器有：玻璃圓形水浴鍋；通氣泵；測(cè)量pH值和Eh的復(fù)合電極(Pt, Ag/AgCl)(JENCO，美國(guó)任氏公司生產(chǎn))；原子吸收儀(北京華洋分析儀器有限公司生產(chǎn))；恒流泵(HL-2S，上海滬西分析儀器有限公司生產(chǎn))。

實(shí)驗(yàn)試劑為：重鉻酸鉀溶液，Taq DNA 聚合酶(MBI，USA)；pGEM-T 載體(Promega，USA)；內(nèi)切酶MspⅠ和Hin 6 Ⅰ ( M BI)。測(cè)序由北京三博遠(yuǎn)志生物公司完成。

1.4 分析方法

每2 d取樣分析，用原子吸收方法測(cè)定浸出液中總Fe2+和Cu2+的濃度，用重鉻酸鉀滴定法測(cè)定Fe2+的濃度，在總鐵含量中去除Fe2+含量即為Fe3+含量。應(yīng)用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定菌數(shù)；每天記錄浸出液的 pH值和Eh值。浸出結(jié)束后得到的礦渣經(jīng)洗滌及冷凍干燥后，與未浸出的礦樣一起應(yīng)用化學(xué)滴定分析的方法測(cè)定銅的含量，計(jì)算銅的浸出率。

1.5 RFLP分析

1.5.1 DNA的提取

每隔 6～8 d取浸出液 100 mL(含固體)提取總DNA，提取方法參照文獻(xiàn)[10]。方法如下：在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心固液混合樣品，去除上清液，剩余物冷凍干燥后與2 g干熱滅菌的沙子混合，加液氮研磨3次，用13.5 mL的DNA抽提緩沖液(0.1 mol/L 磷酸鈉，0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L EDTA，1.5 mol/L NaCl，1% CTAB (pH=8.0))溶解研磨產(chǎn)物，加入50 μL蛋白酶K (10 g/L)，經(jīng)37 ℃水浴30 min，加入1.5 mL 20%的SDS，于65 ℃水浴2 h(每隔15 min輕微搖動(dòng)1次)，于4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，然后，加入等體積異丙醇，混勻并放入4 ℃冰箱中過(guò)夜, 最后以10 000 r/min離心15 min，棄上清液并加入2 mL預(yù)冷的70%乙醇洗滌2次，于室溫干燥后用100 μL TE溶解。粗提DNA，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(OMEGA，USA)進(jìn)行回收純化。

1.5.2 PCR擴(kuò)增和純化

提取得到的總DNA，用16S rRNA基因通用引物63F，1387R(63F：5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’；1387R：5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’)來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增[12]，對(duì)所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。所得片段長(zhǎng)度為1.4 kb左右。

1.5.3 克隆

其次，你們需要接受自己，獲得自信能量。初中階段的你們不僅小秘密多了，情感也更加細(xì)膩敏感。越優(yōu)秀的學(xué)生對(duì)自我的認(rèn)同感就越高，一旦理想和現(xiàn)實(shí)出現(xiàn)差距，失落感就會(huì)更強(qiáng)烈。這時(shí)候，如果能客觀認(rèn)識(shí)現(xiàn)狀，接受成長(zhǎng)中的自己，讓自己的優(yōu)點(diǎn)更加“明亮”，缺點(diǎn)更加“暗淡”，我一定會(huì)離你們遠(yuǎn)遠(yuǎn)的。

把純化后的片段連接到pGEM-T載體中，在16 ℃水浴中過(guò)夜，轉(zhuǎn)化到Ecoli DH5α[0]感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。涂平板用藍(lán)白篩選的方法挑選出陽(yáng)性克隆子。利用通用載體引物 M13F(5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’)和 M13R(5’-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3’)對(duì)菌落PCR擴(kuò)增出插入片斷。然后，用內(nèi)切酶MspⅠ和Hin 6Ⅰ對(duì)插入片斷進(jìn)行酶切，在37 ℃酶切24 h。最后，用 3%的瓊脂糖凝膠作酶切分析，得到圖譜。對(duì)顯現(xiàn)不同條帶的克隆子(OTU)進(jìn)行測(cè)序，在GENBANK中進(jìn)行序列比對(duì)，鑒定細(xì)菌種類。

2 結(jié)果和分析

2.1 浸出實(shí)驗(yàn)

浸出液中微生物含量的變化見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)：經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后在第 7天左右細(xì)菌濃度達(dá)到最大，為2.6×107個(gè)/mL；然后略有下降。但是，基本維持在2×107個(gè)/mL以上。經(jīng)推測(cè)，部分菌體已經(jīng)吸附到礦物顆粒上。

圖2 浸出液中微生物含量的變化Fig.2 Variation of cell number in leachate

浸出液中pH和Eh變化曲線見(jiàn)圖3?？梢?jiàn)：接種后電位為400 mV，在第1天內(nèi)電位很快升高，然后緩慢上升，在第15天到第19天這一階段又有一個(gè)比較明顯的上升階段，然后，電位穩(wěn)定在660 mV左右。與電位相對(duì)應(yīng)，pH值在第1天內(nèi)下降比較明顯，然后，一直呈平緩下降的趨勢(shì)。在浸出過(guò)程的后期，pH值基本保持不變。

使用重鉻酸鉀滴定法測(cè)定溶液中Fe2+的質(zhì)量濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)圖4)：浸出液中Fe2+質(zhì)量濃度非常低，應(yīng)用原子吸收所測(cè)定的總鐵濃度近似等于 Fe3+質(zhì)量濃度；在第16天左右，總鐵的質(zhì)量濃度最高，達(dá)到0.72 g/L，然后開(kāi)始下降，到反應(yīng)結(jié)束時(shí)下降到0.49 g/L。銅的浸出持續(xù)增加，浸出液中 Cu2+的質(zhì)量濃度最高達(dá)到0.63 g/L。應(yīng)用化學(xué)滴定分析法，計(jì)算得出最后Cu的浸出率為 26.2%。該浸出率不高，可能與銅精礦殘留的浮選藥劑有關(guān)，即浸礦微生物活性受到了一定程度的抑制。

圖3 浸出液中pH和Eh變化曲線Fig.3 Variations of pH and Eh in leachate

圖4 浸出液中Cu2+和Fe2+的質(zhì)量濃度變化曲線Fig.4 Concentrations of Fe2+ and Cu2+ in leachate

2.2 微生物群落分析

在第8，16，24和第30天分別取樣，因?yàn)椴町悧l帶只有3種，所以，每個(gè)樣挑取80個(gè)左右白色菌落，可足夠保證結(jié)果的可靠性。陽(yáng)性克隆的比例為96%。酶切圖譜的條帶類型見(jiàn)圖5。從酶切圖譜來(lái)看，各階段OTU數(shù)量的差異性比較明顯。挑選差異性的3個(gè)陽(yáng)性克隆子測(cè)序，在GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)2種是At. caldus，分別編號(hào)為AC-1和AC-2；1種為L(zhǎng). ferriphilum，編號(hào)為L(zhǎng)F ；沒(méi)有檢測(cè)到代表其他菌種的OTU。在NCBI上比對(duì)后發(fā)現(xiàn)AC-1和AC-2序列與登錄號(hào)為DQ661629.1的At. caldus相似度達(dá)到99%，LF的序列與登錄號(hào)為EF025338.1的L. ferriphilum相似度達(dá)到99%。

圖5 酶切圖譜的條帶類型Fig.5 RFLP pattern of 16S rRNA gene digested by restriction enzymes

在第8天時(shí)，群落中占優(yōu)勢(shì)地位的是At. caldus。總共挑取 82個(gè)克隆子，AC-1樣占全部克隆子數(shù)的62%，AC-2占全部克隆子數(shù)的34%，At. caldus總共占96%；代表L. ferriphilum的LF僅占全部克隆子數(shù)的4%。

到第16天時(shí)，84個(gè)陽(yáng)性克隆子中AC-1占總數(shù)的31%，AC-2占總數(shù)的21%，At. caldus總共占52%；LF占總數(shù)的48%。At. caldus和L. ferriphilum兩者的數(shù)量已經(jīng)基本相當(dāng)。

到第24天時(shí)，87個(gè)陽(yáng)性克隆子中AC-1占總數(shù)的33%，AC-2占總數(shù)的17%，At. caldus總共占50%；LF占總數(shù)的50%。At. caldus和L. ferriphilum的數(shù)量仍然基本相當(dāng)。

3 討論

黃銅礦的氧化過(guò)程開(kāi)始于質(zhì)子對(duì)礦物的攻擊和Fe3+的氧化攻擊[11?12]。由黃銅礦的晶格結(jié)構(gòu)可知，它的化合價(jià)鍵在S，Cu和Fe之間相互形成，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，鍵能很高。在電子傳遞過(guò)程中，F(xiàn)e3+和H+攻擊黃銅礦的晶格結(jié)構(gòu)，接受S與金屬之間化合鍵斷裂后的電子，使Cu2+和Fe2+釋放到溶液中。其中，浸礦細(xì)菌所起的作用是將Fe2+氧化為Fe3+，將S氧化為硫酸。生成的Fe3+可以繼續(xù)對(duì)礦物起氧化作用。具體反應(yīng)[13]如下：

浸出過(guò)程發(fā)生的反應(yīng)很復(fù)雜，除上述反應(yīng)外，浸出液中還會(huì)發(fā)生如下反應(yīng)：

在每個(gè)浸出實(shí)驗(yàn)中，都能觀察到 pH值的持續(xù)下降和Eh的持續(xù)升高[14]。這是因?yàn)榻鲞^(guò)程是一個(gè)不斷產(chǎn)酸和有Fe3+釋出的過(guò)程。氧化還原電位Eh由液相中的主要離子對(duì)濃度比 c(Fe3+)/c(Fe2+)和 c(H+)/c(OH?)來(lái)決定。當(dāng)溶液中Fe2+濃度非常低時(shí)，Eh取決于Fe3+濃度及 pH值的變化[15]。從反應(yīng)式(2)～(6)可以看出：浸出過(guò)程中不斷產(chǎn)生H+，使pH值持續(xù)下降。由反應(yīng)式(1)可知：當(dāng)細(xì)菌濃度增大并起氧化作用后，浸出液中Fe3+濃度也將越來(lái)越高，所以，電位也隨之升高(如圖3)。

影響黃鉀鐵礬形成的主要因素包括pH值、溫度及硫酸鐵介質(zhì)的濃度[16]。當(dāng)溫度恒定時(shí)，主要受H+和硫酸鐵介質(zhì)濃度的影響。如反應(yīng)式(3)～(6)所示，鐵沉淀的生成使溶液中如 K+，SO42?，NH4+等許多離子的濃度都發(fā)生了變化。從圖4可知：在第16天以后，浸出液中Fe2+質(zhì)量濃度開(kāi)始下降，可推測(cè)是黃鉀鐵礬大量生成的緣故。從圖3可以看出，當(dāng)生成黃鉀鐵礬時(shí)Eh有上升的趨勢(shì)。這是因?yàn)?H+增加，此階段 pH值下降。

由RFLP分析可知：該中等嗜熱槽浸系統(tǒng)中微生物多樣性并不豐富，只有L. ferriphilum 和At. caldus被檢測(cè)到，生物多樣性遠(yuǎn)低于酸性礦坑水或堆浸系統(tǒng)中的多樣性。這主要是因?yàn)椴劢到y(tǒng)的溫度恒定，而且pH值、氧氣、CO2、營(yíng)養(yǎng)物水平都較均一。Foucher等[17]通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)機(jī)械攪拌反應(yīng)器和氣升式懸浮顆粒柱狀反應(yīng)器中微生物群落組成情況進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：L. ferrooxidans，At. caldus以及 S. thermosulfidooxidans是這2種反應(yīng)器中主要的微生物種群。可見(jiàn)：這些反應(yīng)器內(nèi)的種群多樣性同樣并不豐富。

在浸出開(kāi)始時(shí)，At. caldus是優(yōu)勢(shì)菌，豐度為96%，在浸出進(jìn)行過(guò)程中，L. ferriphilum逐漸占主導(dǎo)地位，豐度為69%。這可能是礦物溶解后釋出的硫元素轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗔蚧衔锔采w在礦物表面，在浸礦體系中最后氧化得到由元素硫形成的一層硫膜，而 At. caldus可以氧化元素硫變成硫酸[11]。只有在硫膜被逐漸溶解，礦物中慢慢釋放出Fe2+的情況下，L. ferriphilum才能迅速生長(zhǎng)并起作用。此外，還存在鐵濃度、pH值、Eh等因素的影響。Okibe等[18]的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在低 pH值和高離子選擇壓力下，Leptospirillum spp.和Ferroplasma spp.將成為浸出過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)種群，相反，在pH值較高時(shí)，Acidithiobacillus 和 Sulfobacillus是群落中的主要成員。Demergasso等[19]的研究表明：Leptospirillum spp.的生長(zhǎng)與pH值密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)所用的At. caldus最適pH值為2.3左右，L. ferriphilum的最適pH值為1.6左右；L. ferriphilum比At. caldus能夠耐受更高的離子選擇壓力。因此，在第8天的樣品中，L. ferriphilum的含量只占微生物總量的4%；在浸出結(jié)束的第30天的樣品中，L. ferriphilum的含量達(dá)到了微生物總量的69%，這可能與pH值下降有關(guān)。

4 結(jié)論

(1) 中等嗜熱混合菌浸出黃銅礦過(guò)程中溶液 pH值逐漸下降，Eh持續(xù)升高，這是因?yàn)榻鲶w系的復(fù)雜反應(yīng)不斷產(chǎn)酸并有Fe3+釋出。浸出中間階段Fe3+質(zhì)量濃度下降，是由于有黃鉀鐵礬沉淀生成。

(2) 槽式攪拌反應(yīng)器中浸出黃銅礦精礦的微生物群落結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，微生物種類不豐富，應(yīng)用 PCR-RFLP方法只檢測(cè)到 2種微生物，分別為 At. caldus和L. ferriphilum。這是因?yàn)榉磻?yīng)器浸出體系的選擇壓力更大。

(3) 槽式攪拌反應(yīng)器中浸出黃銅礦精礦的群落動(dòng)態(tài)變化很明顯。在浸出開(kāi)始階段，At. caldus 是優(yōu)勢(shì)種群，其豐度為96%。隨著浸出的進(jìn)行，L. ferriphilum 逐漸增多，在浸出后期代替At. caldus成為優(yōu)勢(shì)種群，其豐度為69%。

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