幾種激素對結(jié)球甘藍(lán)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

王神云，李建斌，王 紅，萬雁玲，丁萬霞 (江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，江蘇 南京210014)

幾種激素對結(jié)球甘藍(lán)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

王神云，李建斌，王 紅，萬雁玲，丁萬霞
(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，江蘇 南京210014)

以結(jié)球甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.capitata)2個基因型475和476為材料，研究了KT、2,4-D、6-BA對結(jié)球甘藍(lán)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，2,4-D在結(jié)球甘藍(lán)花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)中作用最大，KT次之，而6-BA的作用基本可以忽略。激素互作效應(yīng)中，2,4-D對結(jié)球甘藍(lán)花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)作用基本不受6-BA的影響，2,4-D與KT的互作效應(yīng)顯著，KT與6-BA的互作效應(yīng)相對復(fù)雜。激素組合中以2.0 mg/L 2,4-D+ 1.0 mg/L KT(H7處理)的愈傷組織誘導(dǎo)率最高。

結(jié)球甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.capitata)；花藥培養(yǎng)； 激素；愈傷組織；誘導(dǎo)率

自Guha等[1]1964年首次從毛曼陀羅(Daturainoxia)建立花藥培養(yǎng)以來，該技術(shù)一直受到遺傳育種界的關(guān)注，近年來進(jìn)展很快，其中茄科(Solanaceae)和禾本科(Poaceae)居多[2，3]。十字花科蔬菜中，蘿卜(Raphanussativus)[4]、花椰菜(B.oleraceavar.italica)[5]、大白菜(B.rapassp.pekinensis)[6]等也開展了花藥培養(yǎng)的研究并取得一定成果。植物的花藥培養(yǎng)一般都是通過培養(yǎng)基中加入激素誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，再促使愈傷組織分化形成植株，培養(yǎng)基中激素的種類、濃度和配比，常常對誘發(fā)小孢子啟動、分裂、生長和分化具有很大的影響，是花藥愈傷組織形成的主要因素，但不同植物或同種植物不同基因型要求的激素組合和濃度有所區(qū)別[7～9]。

結(jié)球甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.capitata)是我國栽培面積較大的蔬菜作物之一，在蔬菜的周年供應(yīng)中占有重要的地位。然而，國內(nèi)對結(jié)球甘藍(lán)花藥培養(yǎng)影響因子的研究甚少。陳世儒等[10]通過皺葉甘藍(lán)花藥培養(yǎng)獲得了單倍體植株，王超楠等[11]對羽衣甘藍(lán)(B.oleraceavar.acephala)進(jìn)行花藥培養(yǎng)并獲得了單倍體植株。這些研究雖獲得一定成功，但存在誘導(dǎo)率較低等問題。本研究以結(jié)球甘藍(lán)2個基因型為材料，選用KT、2,4-D、6-BA 3種激素研究不同激素配比、濃度對結(jié)球甘藍(lán)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響，以期為建立完善的結(jié)球甘藍(lán)花藥培養(yǎng)體系提供依據(jù)，進(jìn)而為結(jié)球甘藍(lán)花藥培養(yǎng)育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試結(jié)球甘藍(lán)基因型為475、476，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。2009年7月播種，高畦栽培過冬。2010年3～5月陸續(xù)開花，于初花期從生長健壯、無病蟲害的結(jié)球甘藍(lán)植株上取綠色、長2～4 mm花蕾帶回實驗室進(jìn)行花藥培養(yǎng)。

主要藥劑2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、6-芐氨基嘌呤(6-BA)和激動素(KT)均購自上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.2 方法

(1)材料的處理與培養(yǎng) 取新鮮的花蕾，用體積分?jǐn)?shù)75% 酒精浸泡60 s，再浸入質(zhì)量濃度0.1% HgCl2溶液中消毒8 min后，用無菌水沖洗3次，然后置于墊有消毒濾紙的培養(yǎng)皿中，吸去多余水分，用鑷子剝開花蕾，取下花藥備用，接種到培養(yǎng)基中。以B5(5 g/L 瓊脂，60 g/L蔗糖，pH 5.8)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

(2)激素組合的誘導(dǎo)培養(yǎng) 以B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，激素配比按正交試驗設(shè)計，每個處理9皿，每皿15個花藥進(jìn)行培養(yǎng)，以篩選結(jié)球甘藍(lán)花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織的最佳激素組合。

(3)培養(yǎng)條件 接種后先在30 ℃下暗培養(yǎng)2 d，然后轉(zhuǎn)入25 ℃暗培養(yǎng)2周左右，再轉(zhuǎn)入25 ℃，光強為3000 ～ 4 000 lx，12 h/12 h光/暗條件下培養(yǎng)，3周左右進(jìn)行愈傷組織統(tǒng)計。

(4)數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)利用正交設(shè)計軟件和DPS軟件進(jìn)行處理。誘導(dǎo)率(%) =花藥胚狀體或愈傷組織塊數(shù)/接種花藥數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)球甘藍(lán)花藥愈傷組織的形成和發(fā)生

將花藥接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(圖版Ⅲ圖1A)后，先在30 ℃下暗培養(yǎng)2 d，然后轉(zhuǎn)入25 ℃暗培養(yǎng)2周左右，再轉(zhuǎn)入25 ℃光培養(yǎng)室培養(yǎng)，花藥陸續(xù)膨大，花藥開始發(fā)生縱裂進(jìn)入分裂期，形成結(jié)構(gòu)疏松而透明的組織(圖版Ⅲ圖1B)；隨后細(xì)胞團繼續(xù)分化，形成一團沒有分化能力的愈傷組織塊(圖版Ⅲ圖1C)。結(jié)果顯示，不同預(yù)處理時間和培養(yǎng)基上的花藥都能誘導(dǎo)出愈傷組織，愈傷先從藥絲口處形成；接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上30 d后，沒有形成愈傷組織的花藥逐漸發(fā)褐死亡。

2.2 激素對結(jié)球甘藍(lán)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

(1)不同激素對結(jié)球甘藍(lán)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響 從圖2和表1可以看出，2,4-D濃度越高，結(jié)球甘藍(lán)花藥愈傷誘導(dǎo)率越高，當(dāng)2,4-D的濃度達(dá)到2.0 mg/L時，475、476 2個材料愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到最高，分別是28.59%和41.28%，而且2,4-D在2個基因型中誘導(dǎo)率極差較大，分別是19.26%、24.98%，說明2,4-D對結(jié)球甘藍(lán)花藥培養(yǎng)影響較大；圖1的6-BA的效應(yīng)曲線表明，2個基因型475、476在未加入6-BA的培養(yǎng)基上愈傷誘導(dǎo)率最高，隨著培養(yǎng)基中加入6-BA濃度的增大，愈傷誘導(dǎo)率發(fā)生下降的現(xiàn)象，但是幅度很小，分別是1.86%和3.87%，說明6-BA在結(jié)球甘藍(lán)花藥培養(yǎng)中的影響很??；從KT的曲線效應(yīng)圖看出，KT濃度為1.0 mg/L時475和476愈傷誘導(dǎo)率最高，分別是20.00%、32.76%，當(dāng)KT濃度達(dá)到2.0 mg/L時，誘導(dǎo)率稍有下降，2個基因型隨KT濃度的改變誘導(dǎo)率振幅分別為2.96%和6.09%，說明KT對結(jié)球甘藍(lán)花藥培養(yǎng)有一定的影響。結(jié)果表明，參試的3種激素及試驗濃度范圍內(nèi)，2,4-D的濃度對結(jié)球甘藍(lán)花藥培養(yǎng)影響最大，其次是KT，6-BA基本無影響。

圖2 不同激素對結(jié)球甘藍(lán)花藥愈傷組織誘導(dǎo)影響的效應(yīng)圖Figure 2 The effects of different hormone on anther callus induction

(2)不同激素組合對結(jié)球甘藍(lán)花藥愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響 由表1可以看出，各個激素組合的培養(yǎng)基都能誘導(dǎo)出一定數(shù)量的愈傷組織，激素組合中2.0 mg/L 2,4-D+ 1.0 mg/L KT 2個基因型的花藥愈傷誘導(dǎo)率都最高，分別達(dá)到35.56%和55.56%，而激素組合0.5 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L

表1 正交設(shè)計不同激素組合處理花藥愈傷組織誘導(dǎo)率Table 1 The callus induction frequency of the different hormone compositions

KT，2個基因型愈傷誘導(dǎo)率均最低，只有4.44%。盡管不同的激素組合的花藥愈傷誘導(dǎo)率存在較大的差別，2個基因型的極差分別為31.12%和51.12%，但不同的激素組合處理2個基因型愈傷誘導(dǎo)效果基本無區(qū)別。結(jié)果表明，2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L KT激素組合的結(jié)球甘藍(lán)愈傷誘導(dǎo)效果最好。

3 討論

植物的花藥培養(yǎng)一般都是通過培養(yǎng)基中加入激素產(chǎn)生愈傷組織，再促使愈傷組織分化形成植株，激素的種類、濃度和配比，對誘發(fā)小孢子啟動、分裂、生長和分化影響很大。本研究選用的2,4-D、6-BA、KT中，2,4-D對結(jié)球甘藍(lán)愈傷和胚狀體形成影響最大，這與陳曉等[7]、楊博智等[8]等在辣椒上的研究結(jié)果一致，可能在花藥離體培養(yǎng)過程中，2,4-D對花粉的啟動、分裂、形成愈傷組織和胚狀體起著決定性的作用，但2,4-D濃度上限還有待進(jìn)一步研究。

本研究的正交試驗設(shè)計結(jié)果表明，結(jié)球甘藍(lán)花藥愈傷誘導(dǎo)最優(yōu)激素組合為2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L KT，當(dāng)2,4-D為2.0 mg/L時，KT為2.0 mg/L，誘導(dǎo)率下降了10%以上；當(dāng)2,4-D為2.0 mg/L時，6-BA為0 mg/L時誘導(dǎo)率最高，而6-BA為 0.5 mg/L和1.0 mg/L，誘導(dǎo)率均降低，可能6-BA濃度梯度范圍設(shè)置在0～0.5 mg/L間，結(jié)球甘藍(lán)花藥愈傷誘導(dǎo)較敏感，或者6-BA對KT影響結(jié)球甘藍(lán)花藥愈傷誘導(dǎo)有負(fù)效應(yīng)，但影響很??；當(dāng)3種激素同時加入培養(yǎng)基中，結(jié)球甘藍(lán)花藥愈傷誘導(dǎo)率變幅比較大，即影響大。激素間的互作效應(yīng)比較復(fù)雜，因此激素對結(jié)球甘藍(lán)花藥愈傷誘導(dǎo)的傳導(dǎo)機制網(wǎng)絡(luò)有待深入研究。前人對茄科和禾本科作物的研究[2，3]表明，愈傷組織的誘導(dǎo)除受培養(yǎng)基激素的種類和配比影響較大外，還受植物基因型、花藥發(fā)育時期、花蕾預(yù)處理等影響，所以要建立完善的結(jié)球甘藍(lán)花藥愈傷組織誘導(dǎo)體系還需要進(jìn)一步深入研究。本研究為結(jié)球甘藍(lán)花藥愈傷組織誘導(dǎo)體系的建立奠定了必要的基礎(chǔ)。

[1]Guha S,Maheshwari S C.Invitroproduction of embryos from anthers of Datura[J].Nature,1964,204:497.

[2]Tara D S.Indicarice anther culture:can the impasse be surpassed?[J].Plant Cell Tiss Organ Cult,2010,100:1～11.

[3]Nowaczyk P,Kisiala A.Effect of selected factors on the effectiveness ofCapsicumannuumL.anther culture[J].J Appl Genet,2006,47:113～117.

[4]梅時勇，楊保國，姚 芳，等．蘿卜花藥培養(yǎng)實驗[J]．中國蔬菜，2002，(1)：35～36．

[5]陳國菊，雷建軍，曹必好，等．花椰菜花藥培養(yǎng)研究[A]．中國園藝學(xué)會．中國園藝學(xué)會第六屆青年學(xué)術(shù)討論會論文集[C]．西安：陜西科技出版社，2004．392～396．

[6]李 丹，馮 輝，劉如娥，等．大白菜黃心品種花藥培養(yǎng)影響因素的研究[J]．北方園藝，2009，(11)：71～73．

[7]陳 曉，詹玉絲，徐小利，等．花藥培養(yǎng)建立辣椒DH 純系的初步研究[J]．河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，(9)：52～55．

[8]楊博智，周書棟，張竹青，等．不同培養(yǎng)基和激素對辣椒花藥培養(yǎng)的影響[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009，35(1)：61～64．

[9]王紹輝，高遐虹，程繼紅，等．蘿卜花藥愈傷組織誘導(dǎo)及褐變因素初探[J] ．中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24(11)：350～354．

[10]陳世儒，劉雁雨．皺葉甘藍(lán)花藥培養(yǎng)再生單倍體植株[J]．植物生理學(xué)通訊，1991，27 (1):41．

[11]王超楠，馮 輝，姜鳳英，等．羽衣甘藍(lán)花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)初報[J]．中國蔬菜，2006，(6)：23～24．

2010-08-25

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項目(cx(09)127)；江蘇省科技支撐計劃項目(BE2008378)；國家“863”計劃項目(2006AA100108)

王神云(1980-)，女，內(nèi)蒙古巴彥淖爾人，農(nóng)學(xué)碩士，助理研究員，主要從事蔬菜育種研究.

李建斌，E-mail:jbli0518@163.com.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.03.017

S635.1

A

1673-1409(2010)03-S048-03