胞內(nèi)聚-β-羥基丁酸酯對蘇云金芽胞桿菌營養(yǎng)細胞耐受性的影響

胞內(nèi)聚-β-羥基丁酸酯對蘇云金芽胞桿菌營養(yǎng)細胞耐受性的影響

以蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)BMB171及其聚-β-羥基丁酸酯(Poly-3-hydroxybutyrate，PHB)合成基因簇(phaRBC)強化菌株BMB171+p和PHB合成酶基因(phaC)阻斷突變株BMB171-p為研究對象，系統(tǒng)比較BMB171及其PHB基因強化和阻斷菌株之間對逆環(huán)境耐受能力(包括耐熱、抗凍、抗紫外和耐饑餓)的差別。結(jié)果表明：胞內(nèi)PHB能增強蘇云金芽胞桿菌菌體對逆環(huán)境的耐受能力。

聚-β-羥基丁酸酯；蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)；逆境生理；耐受性

聚-β-羥基丁酸酯(Poly-3-hydroxybutyrate，PHB)是微生物細胞在其生長的特定時期在胞內(nèi)合成具有相應(yīng)功能的聚羥基烷酸酯，它可作為菌體內(nèi)的一種儲備性碳源[1]。此外，還發(fā)現(xiàn)細菌胞內(nèi) PHB在菌株對逆環(huán)境的耐受性中扮演著重要角色。Lopez等[2]對巨大芽胞桿菌(Bacillusmegatroium)和其PHB合成缺陷型突變株在土壤中生存能力進行對比實驗，發(fā)現(xiàn)積累PHB對巨大芽胞桿菌在自然環(huán)境中生存是一種優(yōu)勢。戴美學(xué)等[1]發(fā)現(xiàn)苜蓿根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)PHB合成缺陷型表現(xiàn)出生長競爭能力的嚴重缺陷和競爭結(jié)瘤能力的大幅度下降。另外通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件比較Pseudomonassp.在產(chǎn)PHB和不產(chǎn)PHB 2種情況下菌株耐熱以及抗氧化的能力，結(jié)果表明能夠產(chǎn)生PHB的菌株對逆環(huán)境具有更強的抗性[3]。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一種昆蟲致病菌，對鱗翅目、鞘翅目等農(nóng)林業(yè)害蟲及蚊蟲等衛(wèi)生害蟲具有殺蟲活性，是應(yīng)用最為廣泛的微生物殺蟲資源。Bt在生長階段，能夠積累聚-β-羥基丁酸(PHB)，可作為合成芽胞和殺蟲晶體蛋白的能源儲藏物質(zhì)[3]。為探討蘇云金芽孢桿菌胞內(nèi)的PHB是否也扮演細胞抗逆角色，本研究以無質(zhì)粒突變株BMB171及其PHB合成基因簇(phaRBC)強化菌株 BMB171+p和PHB合成酶基因(phaC)阻斷突變株 BMB171-p為對象，考察對數(shù)期末期營養(yǎng)體細胞對逆環(huán)境條件處理(包括熱處理、冷處理、紫外輻照以及饑餓處理)的存活能力。

國內(nèi)外對于蘇云金芽胞桿菌中PHB的生理功能還未有具體報道。通過研究蘇云金芽胞桿菌中PHB對菌體生理的影響，揭示了PHB在蘇云金芽胞桿菌中所扮演的生物學(xué)功能，為進一步深入研究蘇云金芽胞桿菌中PHB的代謝奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

蘇云金芽胞桿菌無質(zhì)粒突變株BMB171(B.thuringiensissubsp.kurstakiBMB171 )；蘇云金芽胞桿菌工程菌株BMB171+p， 來源于BMB171， 通過轉(zhuǎn)入帶有PHB合成基因簇(phaRBC)的質(zhì)粒載體pHT304， 構(gòu)建成PHB高產(chǎn)突變株；蘇云金芽胞桿菌工程菌株BMB171-p，來源于BMB171，通過與帶有PHB合成基因部分同源片段的質(zhì)粒pEG491 進行同源重組， 阻斷PHB合成酶基因phaC， 得到PHB合成缺失突變株。所有菌株均由筆者所在實驗室構(gòu)建并保存。

1.2 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，酵母浸粉 5 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 000 mL；初始pH 7.2～7.5，120 ℃，15 min滅菌。

(2)種子培養(yǎng)基 LB 液體培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，酵母浸粉 5 g，蒸餾水1 000 mL；初始pH 7.2～7.5,15 min滅菌。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基 PM培養(yǎng)基：蛋白胨10 g， 葡萄糖5 g， 酵母抽提物2 g，KH2PO41.0 g， MgSO4·7H2O 0.3 g， FeSO4·7H2O 0.02 g，ZnSO4·7H2O 0.02 g，MnSO4·H2O 0.02 g，初始pH 7.2～7.5，115 ℃，20 min滅菌待用。

1.3 方法

(1)菌液制備 將斜面菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 h(30 ℃， 200 r/min )，然后取0.2 mL接入20 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)10 h(30 ℃，200 r/min)后，5 000 r/min離心10 min收集菌體，用磷酸緩沖液(pH 6.8 )洗滌2次后加無菌水恢復(fù)至原來體積，放置備用。

(2)耐熱試驗 吸取0.5 mL 菌液加入到已預(yù)熱好的裝有4.5 mL無菌水的試管中，分別用45 ℃、50 ℃ 、55 ℃和60 ℃ 4種溫度水浴恒溫加熱，稀釋平板計數(shù)，測定殺死90%的菌體所需要的時間。

(3)低溫耐受試驗 將菌體在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期，分裝至1.5 mL 離心管中，放置-20 ℃低溫冰柜中，5 d后稀釋平板計數(shù)，計算存活率。

(4)抗紫外試驗 將菌液稀釋100倍，取30 mL放入平板中，于距離40 W紫外燈55 cm處分別照射40、60、80、160 s，稀釋平板計數(shù)，計算存活率。

(5)耐饑餓試驗 將菌液分裝至1.5 mL 離心管中，室溫(25 ℃ )放置，每天稀釋平板計數(shù)，計算存活率。

1.4 指標(biāo)測定

生物量測定采用稀釋平板記數(shù)法[5]；同步率測定采用顯微計數(shù)法[5]；胞內(nèi)PHB的檢測采用蘇丹黑染色和顯微照相[6]；胞內(nèi)PHB濃度測定采用紫外分光光度計測定法[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇云金芽胞桿菌BMB171及其PHB基因強化和阻斷菌株在對數(shù)生長末期PHB的合成

蘇云金芽胞桿菌在斜面保存中以芽孢形式存在，將芽孢接入種子培養(yǎng)基中復(fù)蘇，復(fù)蘇后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中生長，對每一種蘇云金芽胞桿菌都可以保證群體同步生長。通過蘇丹黑染色可以發(fā)現(xiàn)，處于對數(shù)生長期的BMB171(BMB171+p同 )菌株菌體中能看到明顯的墨黑色顆粒，而同時期的BMB171-p菌體中不存在(圖1)，說明BMB171(BMB171+p同 )能正常表達產(chǎn)生PHB顆粒存在于體內(nèi)，而PHB合成基因缺失的突變株BMB171-p不能生成PHB。通過制作3種蘇云金芽胞桿菌的生長曲線可以看出，菌體中PHB合成與菌體生長偶聯(lián)，PHB含量在對數(shù)生長期末期達到最大(圖2)。進一步測定菌株在對數(shù)生長末期PHB的含量，詳見表1。

a.BMB171(BMB171+p圖略，同BMB171;b.BMB171-p圖1 蘇丹黑染色后處在對數(shù)生長期的3種菌菌體形態(tài)(1 000×)Figure 1 The morphology of the three kinds of logarithmic growth phase cells by sudan black staining(1 000×)

2.2 蘇云金芽胞桿菌BMB171及其PHB基因強化和阻斷菌株耐受試驗

(1)耐熱性試驗 分別測定受4種溫度(45、50、55、60 ℃)處理的對數(shù)生長末期營養(yǎng)體細胞的死亡率，計算BMB171及其PHB基因強化和阻斷菌株受熱死亡90%時所需要的時間(即菌體受熱死亡特征值D90)，并對熱處理溫度作圖，詳見圖3。

通過比較BMB171+p、BMB171和BMB171-p3菌株受熱死亡特征值D90值，發(fā)現(xiàn)三菌株的耐熱能力強弱順序為：BMB171+pgt;BMB171gt;BMB171-p。處理溫度為45 ℃ 和50 ℃時，BMB171+p、BMB171菌體的D90值(分別為32.5 min、11.5 min和25 min、9.5 min)遠大于 BMB171-p菌體的D90值(12 min、6 min)，3種菌的D90值區(qū)別顯著(Plt;0.01)；較高溫度(55、60 ℃)時，3種菌的D90值區(qū)別不如較低溫度時明顯。

(2)抗凍性試驗 由表2可見，將3種菌的菌體在-20 ℃下放置5 d后，BMB171+p的菌體還有108CFU/mL存活，存活率為15.91%；BMB 171菌體也有108CFU/mL存活，存活率為 14.93%；而BMB171-p菌體的活菌數(shù)降為107CFU/mL，存活率僅為0.93%。

a.BMB171;b.BMB171+p;c.BMB171-p圖2 蘇云金芽胞桿菌BMB171及其PHB基因強化和阻斷菌株的生長曲線和PHB含量Figure 2 The contents of PHB in growth of BMB171，phaRBC overexpressed strain and phaC inhibitived strain

圖3 3類菌株營養(yǎng)細胞在不同溫度下的D90值Figure 3 The D90 of vegetative cells of three strains at the end of the logarithmic growth phase treated at different temperatures

菌株胞內(nèi)PHB含量/(mg/mL)BMB171+p1.248BMB1710.844BMB171-p0.000

表2 3種菌株營養(yǎng)細胞冷凍耐受存活率Table 2 The survival ratio of vegetative cells of three strains at the end of the logarithmic growth phase treated by frozening

圖4 BMB171及其PHB基因強化和阻斷菌株菌體在紫外下照射不同時間的存活率Figure 4 The survival ratio of three kind of vegetative cells treated by ultraviolet rays at different times

圖5 BMB171及其PHB基因強化和阻斷菌株菌體耐饑餓存活率Figure 5 The survival rates on starvation of vegetative cells of BMB171，phaRBC overexpressed strain and phaC inhibitived strain at the end of the logarithmic growth phase treated with different day

(3)抗紫外試驗 3種菌株對紫外的耐受性試驗結(jié)果見圖4。由圖4可看出，照射40 s時，BMB171+p和BMB171菌體存活率分別為82.18%和72.67%，而BMB171-p 菌株菌體存活率只有4.12%。照射80 s后，BMB171+p 和BMB171菌體存活率基本相同，照射160 s后，活菌數(shù)為107CFU/mL ，BMB171-p 菌體存活率在照射60 s時就降為0.91% ，照射160 s后活菌數(shù)降為105CFU/mL。

(4)耐饑餓試驗 由圖5可知，耐饑餓試驗處理1 d后BMB171的存活率為22.4%，BMB171+p的存活率為25%，BMB171-p的存活率為0.82%；2 d后分別為20.9%、23.9%和0.20%，其中，BMB171+p和BMB171菌株的活菌數(shù)仍為108CFU/mL，而BMB171-p菌株的活菌數(shù)降為107CFU/mL，且BMB171-p菌體出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。

3 結(jié)論與討論

本研究探討了蘇云金芽胞桿菌BMB171及其PHB合成基因增強(phaRBC+)工程菌BMB171+p和PHB合成基因阻斷(phaC-)突變株BMB171-p合成PHB能力及其菌體對環(huán)境耐受性的差別。結(jié)果表明，BMB171+p和BMB171菌株均能在對數(shù)生長期合成PHB，最大量分別為1.248 mg/mL和0.844 mg/mL，而BMB171-p菌株不能合成PHB。通過取對數(shù)末期菌體進行環(huán)境耐受試驗發(fā)現(xiàn)，在熱、寒冷、紫外和饑餓環(huán)境中，BMB171+p和BMB171菌體的存活率均遠遠大于BMB171-p菌體，說明BMB171+p和BMB171菌體對環(huán)境的耐受性明顯強于BMB171-p菌體，其中BMB171+p菌體耐受能力又略強于BMB171菌體。

由于PHB是以顆粒狀和可溶性2種狀態(tài)存在于菌體中，顆粒狀PHB能在胞內(nèi)大量儲存而不影響胞內(nèi)外的滲透壓，是一種理想的儲存材料[7]，可溶性的PHB多為低相對分子質(zhì)量PHB，它被發(fā)現(xiàn)是細胞質(zhì)[8]、質(zhì)膜[9]以及線粒體和微粒體膜[10]的組成成分，并能與其它生物大分子連接在一起，在許多生物體內(nèi)廣泛分布[11]。本研究結(jié)果表明phaC基因的阻斷導(dǎo)致細胞對熱、冷和紫外的抗逆能力急劇下降，推測可能與低相對分子質(zhì)量的PHB合成受阻，從而喪失PHB對細胞膜和細胞質(zhì)有關(guān)活性成分的保護，且PHB具有不飽和雙鍵對紫外有一定的吸收作用；PHB在菌體饑餓時可能參與了碳代謝，增強了菌體的耐饑餓能力。同時，增加胞內(nèi)phaRBC基因簇拷貝數(shù)盡管大幅提高胞內(nèi)PHB的合成量，但僅微弱提高菌體抗逆能力，可能是保護細胞所需的特定性狀PHB量已基本滿足需要。因此可以推斷：蘇云金芽胞桿菌中胞內(nèi)PHB能增強菌體對環(huán)境的耐受性，提高菌體存活能力；并且這種能力和PHB濃度胞內(nèi)的濃度有一定關(guān)系。

雖然胞內(nèi)PHB存在可提高菌體抗逆能力的現(xiàn)象在越來越多的菌株中得到證明，但是否具有普遍性，以及PHB深層次的抗逆機制等問題還有待闡明，同時是否通過PHB合成基因的轉(zhuǎn)入，構(gòu)建對逆環(huán)境耐受性高的工程生物也是值得探索的課題。

[1]戴美學(xué),武 波,柏學(xué)亮,等.苜蓿根瘤菌聚羥丁酸代謝突變體的競爭生長和結(jié)瘤能力以及外源生物素的影響[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2003,11(6):633～637.

[2]Lopez N I,Ruiz J A,Mendez B S.Survival of poly-3-hydroxybutyrate-producing bacteria in soil microcosms[J].World Journal of Microbiology amp; Biotechnology,1998,14:681～684.

[3]Ayub N D,Pettinari M J,Ruiz J A,etal.A Polyhydroxybutyrate-ProducingPseudomonassp.Isolated from Antarctic Environments with High Stress Resistance[J].Current Microbiology,2004,49:170～174.

[4]Benoit T G,Wilson G R,Baugh C L.Fermentation during growth and sporulation ofBacillusthuringiensisHD-1[J].Lett.Appl.Microbial,1990,10:15～18.

[5]李 莉.應(yīng)用微生物學(xué)[M].武漢：武漢理工大學(xué)出版社，2006.286～288.

[6]Slepecky R A,Law J H.Synthesis and degradation of poly-beta-hydroxybutyric acid in connetion with sporulation ofBacillusmegaterium[J].J Bacteriol,1961,82:37～42.

[7]Liu C,Zhang X F.Application of PHB used in production of degradable plastics and research progress in microbial synthesized PHB[J].China Plastics Industry,2005,8(33):1～3.

[8]Reusch R N,Sadoff H L.D-poly-β-hydroxybutyrate in membranes of genetically competent bacteria[J].J Bacteriol,1983,156:778～788.

[9]Reusch R N,Hiske T W,Sadoff H L.Poly-β-hydroxybutyrate membrane structure and its relationship to genetic transformability inEscherichiacoli[J].J Bacteriol,1986,168:553～562.

[10]Reusch R N.Poly-beta -hydroxybutyrate/calcium polyphosphate complexes in eukaryotic membranes[J].Proc Soc Exp Biol Med,1989,191:377～381.

[11]Huang R,Reusch R N.Poly (3-hydroxybutyrate) is associated with specific proteins in the cytoplasm and membranes ofEscherichiacoli[J].J Biol Chem,1996,271:22196～22202.

2010-04-14

嚴 瑾(1982-)，女，湖北孝感人，工學(xué)碩士，助教，研究方向為微生物工程.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.018

Q935

A

1673-1409(2010)02-S058-05