水通道蛋白4在外燥小鼠肺組織表達的實驗研究

丁建中，賀尚榮, 張燕翔 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

李軍川 (長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院病理科，湖北 荊州 434023)

王明明 (湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065)

水通道蛋白4在外燥小鼠肺組織表達的實驗研究

丁建中，賀尚榮, 張燕翔
(長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

李軍川
(長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院病理科，湖北 荊州 434023)

王明明
(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065)

目的：觀察外燥對小鼠肺組織水通道蛋白4(AQP4)表達的影響。方法： 無特定病原體(SPF)級昆明種小鼠60只隨機分為常溫常濕組、常溫燥組、溫燥組和涼燥組，每組15只。免疫組化法檢測各組第6、12、18天小鼠肺組織AQP4陽性表達并進行圖像分析。結(jié)果：各組AQP4陽性表達部位多在肺泡上皮處。與外燥相關(guān)的3個組第12、18天AQP4蛋白表達陽性率持續(xù)下降(P<0.05)，伴明顯肺部炎性病變。結(jié)論：外燥傷肺、耗津之時，伴肺泡液細(xì)胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運相關(guān)的AQP4蛋白表達的下降，提示與其病機相關(guān)。

外燥；鼠；肺；水通道蛋白4(AQP4)

體內(nèi)津液代謝主要與肺、脾相關(guān)，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)可以介導(dǎo)水的快速跨膜運動的非選擇性細(xì)胞膜水通道蛋白(Aquaporin,AQP)有13種，提示AQP為津液輸布的生物學(xué)基礎(chǔ)之一。文獻報道AQP4主要與腦水腫相關(guān)，敲除AQP4基因模型較野生型動物更易抑制腦水腫形成[1]；細(xì)菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性小鼠肺損傷后4～12h明顯肺水腫，伴肺泡AQP4表達減少，在第14天肺水腫減輕時AQP4表達有所恢復(fù)。在前期發(fā)現(xiàn)外燥可致小鼠肺組織炎性病變和肺組織AQP5蛋白表達下降的基礎(chǔ)上[2-3]。筆者動態(tài)觀察外燥對小鼠肺組織AQP4蛋白表達的影響為探尋與其病機特異性病理檢測指標(biāo)的相關(guān)性積累資料。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級昆明種小鼠60只，體質(zhì)量(17±1)g，雌雄各半，湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2008-2005。

1.1.2 試劑和儀器 LRH-250人工智能氣候箱(廣東醫(yī)療器械廠)，兔抗小鼠AQP4多克隆抗體試劑盒(DA0648，200902，武漢博士德公司)。

1.2方法

1.2.1 動物分組與造模 SPF級昆明種小鼠60只隨機分為常溫常濕組、常溫燥組、溫燥組和涼燥組，每組15只，分批置人工氣候箱內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)，按文獻造模[4]。處理后第6、12、18天進行肺組織病理觀察和AQP4蛋白表達檢測。小鼠實驗解剖前4h常規(guī)禁食、禁水。

1.2.2普通病理組織學(xué)觀察 斷頸處死小鼠，常規(guī)取右肺中葉組織2cm×2cm，HE染色，鏡檢。

1.2.3AQP4蛋白表達檢測 取各組第6、12、18天小鼠右肺組織 (0.5cm×0.5cm)常規(guī)行免疫組織化學(xué)法染色。結(jié)果判斷：光鏡下以肺泡周圍及肺泡上皮出現(xiàn)棕色顆粒為陽性；采用JEDA80ID(江蘇捷達公司)圖像分析軟件計算 “平均灰度”與“異形指數(shù)”，并按下式計算AQP4陽性表達率：AQP4表達陽性率(%)= (肺組織AQP4陽性染色面積 /肺組織總面積) ×100%。

2 結(jié) 果

2.1病理觀察常溫常濕組第6天至第18天肺組織未見異常，常溫燥組第12天肺部輕度充血；溫燥組、涼燥組第6天肺泡充血，第12、第18天肺泡瘀血與炎性滲出物加重，伴明顯肺氣腫現(xiàn)象，肺泡隔處明顯增厚伴炎性細(xì)胞浸潤。

2.2外燥對小鼠肺組織AQP4表達的影響見表1。

表1 外燥對小鼠肺組織水通道蛋白4表達的影響

注：與常溫常濕組比較，*P<0.05，**P<0.05; 與常溫燥組比較，△P<0.05；與涼燥組比較，○P<0.05。

2.3外燥對小鼠肺組織AQP4的“平均灰度值”與異形指數(shù)的影響見表2。

表2 外燥對小鼠肺組織水通道蛋白4表達的“平均灰度值：與異形指數(shù)的影響

注：與常溫常濕組比較，*P<0.05。

3 討 論

構(gòu)成水通道蛋白(AQPs)家族通道管上由His182、Arg197、Phe58和Cys191這4個氨基酸殘基構(gòu)成的狹口恰好是一個水分子的大小，每個亞單位構(gòu)成孔徑約0.38nm的水孔通道，其調(diào)節(jié)機制是通過翻譯后蛋白修飾作用和改變單位面積上轉(zhuǎn)運蛋白的含量，在滲透壓驅(qū)動下實現(xiàn)水雙向跨膜轉(zhuǎn)運。AQP4之C端第276～280的5個氨基酸益于AQP4固定于細(xì)胞膜上， AQP4廣泛分布于體內(nèi)，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎、肺、結(jié)腸，也可在支氣管上皮表達。文獻報道AQP4主要與腦水腫相關(guān)，但AQP4剔除小鼠肺泡毛細(xì)血管間水滲透性較野生型小鼠低14～16倍[5-6]。臨床常規(guī)用皮質(zhì)醇類激素促進早產(chǎn)兒肺成熟，可能與促進AQPs表達及胎兒肺內(nèi)液體吸收相關(guān)。

筆者的實驗結(jié)果顯示，AQP4蛋白多在肺泡上皮和肺泡膜緣表達陽性，與文獻報道相符。常溫燥組、涼燥組第6天AQP4蛋白陽性表達率略有升高，但與燥相關(guān)的3個組第12～18天持續(xù)下降，以第12天明顯(P<0.05)；溫燥組第6～18天AQP4表達陽性率持續(xù)下降、伴AQP4陽性表達點數(shù)增多(P<0.05)，顯示外燥可致小鼠肺泡與肺液體細(xì)胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運的水通道蛋白功能下降。

觀測“平均灰度”與“異形指數(shù)”可輔之了解AQP4在肺組織的表達狀態(tài)，表2結(jié)果顯示常溫常濕組第6～18天AQP4陽性表達之“平均灰度值”與“異形指數(shù)”相對穩(wěn)定，濕燥組第6天AQP4陽性表達處的“平均灰度”下降，與燥相關(guān)的常溫燥組、涼燥組與涼燥組第12～18天AQP4陽性表達處的“異形指數(shù)”呈相應(yīng)下降(P<0.05)，顯示其反應(yīng)強度減弱。結(jié)果表明，溫燥傷肺、耗津之時，首則肺組織失之濡養(yǎng)，繼則肺泡液細(xì)胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運相關(guān)的AQP4蛋白表達下降；同期病理組織學(xué)觀察顯示肺泡瘀血、肺泡隔增厚與炎性細(xì)胞浸潤及“肺氣腫”現(xiàn)象。AQP4作為與外燥傷肺病機之特征性檢測指標(biāo)的相關(guān)性值得研究。

[1]ZeleninaM， Zelenin S， Aperia A. Water channels (aquaporins) and their role for postnatal adap tation[J].Pediatr Res， 2005， 57(5 Pt 2)：47-53.

[2] 胡利群，丁建中.水通道蛋白與肺部疾病研究進展[J].長江大學(xué)學(xué)報：自科版醫(yī)學(xué)版，2008，5(4)：83-86.

[3] 張六通，丁建中，王明明，等. 外燥對小鼠肺組織水通道蛋白5表達的影響及意義[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，12(1):3-5.

[4] Matthay MA，F(xiàn)olkesson HG，Clerici C.Lung epithelial fluid transport and the resolution of pulmonary edema[J].Physiol Rev，2002，82(3):569-600.

[5] 丁建中，張六通，龔 權(quán)，等. 溫燥致病機制的實驗研究[J].中醫(yī)雜志，2007，48(11)：1024-1026.

[6] 李波，陳東，王桂芳，等.水通道蛋白1、3、4、5在內(nèi)毒素性急性肺損傷小鼠肺組織中的表達[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，29(2):131-135.

[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2010.03.001

R228.5

A

1673-1409(2010)03-R001-02