紫菜薹子葉離體培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)頻率的研究

林小芳，付明星，劉樂承

(長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

紫菜薹子葉離體培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)頻率的研究

林小芳，付明星，劉樂承

(長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

為比較紫菜薹不同基因型之間的子葉不定芽誘導(dǎo)頻率，以6個(gè)紫菜薹(Brassicacampestrisssp.chinensisvar.purpuraria)品種為試材，在不同的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽，發(fā)現(xiàn)‘十月鮮’紫菜薹的子葉不定芽誘導(dǎo)頻率最高。為確定‘十月鮮’紫菜薹子葉不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基，采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)研究了6-BA、NAA及AgNO3對(duì)‘十月鮮’子葉離體培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)頻率的影響，發(fā)現(xiàn)3個(gè)因素對(duì)子葉不定芽誘導(dǎo)影響的主次關(guān)系為：AgNO3gt;6-BAgt;NAA，最佳培養(yǎng)基是MS+3.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+5.0 mg/L AgNO3，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)85.71%。

紫菜薹(Brassicacampestrisssp.chinensisvar.purpuraria)；子葉；離體培養(yǎng)；植株再生

紫菜薹(Brassicacampestrisssp.chinensisvar.purpuraria)是十字花科蕓薹屬作物，原產(chǎn)我國(guó)，是長(zhǎng)江流域的特產(chǎn)蔬菜，在長(zhǎng)江流域及以南各省普遍栽培。紫菜薹的食用部分為嫩花莖，花莖肥嫩，色澤鮮艷，脆嫩清甜，風(fēng)味獨(dú)特，含有豐富的維生素A、C，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[1]。紫菜薹早熟品種和中晚熟品種分別于國(guó)慶、元旦、春節(jié)前后大量上市，深受大眾的喜愛。作為優(yōu)質(zhì)高檔蔬菜紫菜薹也被逐漸引種到全國(guó)各地栽培[2]。隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)紫菜薹生產(chǎn)和消費(fèi)的要求也日益提高，因此需要選育更多的優(yōu)良品種。采用基因工程技術(shù)導(dǎo)入目的基因改良遺傳特性，無(wú)疑是紫菜薹育種的一個(gè)新途徑。通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入外源目的基因是植物遺傳改良的一種有效手段，而應(yīng)用這種技術(shù)的基礎(chǔ)是建立高效的離體再生體系。盡管紫菜薹的組織培養(yǎng)早有成功的報(bào)道[3]，但是由于基因型不同，實(shí)際應(yīng)用中仍存在許多問題。本研究旨在探討激素配比和基因型對(duì)紫菜薹子葉離體培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)頻率的影響，以期為紫菜薹的遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘十月鮮’、‘新選十月鮮’、‘原種九月鮮’、‘改良九月鮮’、‘早豐’和‘新世紀(jì)中雜’等6個(gè)紫菜薹品種的種子均為市售。

1.2 紫菜薹品種間子葉不定芽誘導(dǎo)的比較

(1)無(wú)菌苗的獲得 以‘十月鮮’、‘新選十月鮮’、‘原種九月鮮’、‘改良九月鮮’、‘早豐’、‘新世紀(jì)中雜’等6個(gè)紫菜薹品種的種子為材料，挑選飽滿的種子，70%乙醇消毒1 min后用無(wú)菌水沖洗3次，再用0.1% HgCl2浸泡10 min后用無(wú)菌水沖洗3次，然后接種于MS培養(yǎng)基中。每個(gè)三角瓶接種30粒種子，置于(26±1)℃、16 h光照及光照強(qiáng)度1 600 lx下培養(yǎng)。

(2)不定芽的誘導(dǎo) 根據(jù)前人報(bào)道[3]和預(yù)備實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，采用3種組合的培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基1：MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA+7.5 mg/L AgNO3；培養(yǎng)基2：MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+5.0 mg/L AgNO3；培養(yǎng)基3：MS+3.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+5.0 mg/L AgNO3，進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)。取5～8 d苗齡無(wú)菌苗帶子葉柄的子葉作為外植體，接種誘導(dǎo)不定芽，20～25片/皿。30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)情況。

不定芽誘導(dǎo)率(%) =(產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))× 100

1.3 6-BA、NAA和AgNO3二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)誘導(dǎo)紫菜薹子葉不定芽

(1)無(wú)菌苗的獲得 以‘十月鮮’紫菜薹為材料，操作步驟同1.2。

表1 因素水平及編碼Table 1 Factor levels and coding

(2)不定芽的誘導(dǎo) 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以6-BA、NAA和AgNO3的不同濃度組成3因素實(shí)驗(yàn)，采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)[4]，實(shí)施情況為全面實(shí)施，零水平試驗(yàn)重復(fù)9次，其變化范圍及其編碼如表1。不定芽誘導(dǎo)的具體操作同1.2。

(3)不定芽的生根誘導(dǎo)及植株移栽 將繼代生長(zhǎng)至長(zhǎng)度1～1.5 cm的不定芽切下，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(1/2MS+2 g/100 g蔗糖+0.8 g/100 g瓊脂+5.0 mg/L AgNO3)上誘導(dǎo)生根。選長(zhǎng)勢(shì)良好的植株開瓶煉苗，洗去根部的培養(yǎng)基，移至裝有培養(yǎng)土的營(yíng)養(yǎng)缽中，塑料薄膜覆蓋保濕2～3 d后按實(shí)生苗植株正常管理。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫菜薹品種間子葉不定芽誘導(dǎo)率的比較

接種培養(yǎng)2～3 d后，紫菜薹子葉柄切口處開始膨大，3～4 d后部分切口形成愈傷組織；8～14 d后，子葉柄切口處以及愈傷組織表面產(chǎn)生紫色芽點(diǎn)，芽點(diǎn)逐漸增大，再生長(zhǎng)2周左右，形成明顯的紫色芽叢。6個(gè)紫菜薹品種在3種培養(yǎng)基上的子葉不定芽的誘導(dǎo)結(jié)果如表2。

方差分析結(jié)果表明，培養(yǎng)基間差異不顯著，但品種間差異達(dá)到極顯著(表3)。進(jìn)一步分析表明，‘十月鮮’的子葉不定芽誘導(dǎo)率顯著或極顯著高于其他5個(gè)品種，‘早豐’的子葉不定芽誘導(dǎo)率顯著或極顯著低于其他5個(gè)品種。這表明，對(duì)這3種培養(yǎng)基而言，6個(gè)品種中‘十月鮮’紫菜薹的子葉不定芽誘導(dǎo)率最高，‘早豐’紫菜薹子葉不定芽誘導(dǎo)率最低。

表3 6個(gè)品種方差分析差異顯著性Table 3 The significant difference of variance analysis between 6 cultivars

表2 不同品種不同培養(yǎng)基子葉不定芽誘導(dǎo)的結(jié)果Table 2 The induction result of cotyledon adventitious buds by different cultivars and different media %

2.2 6-BA、NAA和AgNO3對(duì)‘十月鮮’紫菜薹子葉不定芽誘導(dǎo)的影響

運(yùn)用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的方法組成6-BA、NAA和AgNO33因素試驗(yàn)，子葉不定芽誘導(dǎo)結(jié)果如表4。

從表4可以看出，子葉不定芽誘導(dǎo)率最高達(dá)85.71%，最低為39.39%。方差分析結(jié)果(表5)表明，在本研究中，AgNO3濃度以5.0 mg/L左右為宜，過(guò)高或過(guò)低都不利于子葉不定芽的誘導(dǎo)；6-BA濃度以1.0 mg/L為宜，過(guò)高反而抑制不定芽的誘導(dǎo)；NAA各濃度之間的不定芽誘導(dǎo)率無(wú)顯著差異。由表5的均值可選取‘十月鮮’紫菜薹子葉不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基組合，即MS+3.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+5.0 mg/L AgNO3。

表4 二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of quadratic orthogonal rotary experiment

方差分析和極差的直觀分析結(jié)果(表5)均表明，在因素水平范圍內(nèi)，6-BA、NAA和AgNO3對(duì)子葉不定芽誘導(dǎo)率影響的主次關(guān)系為：AgNO3gt;6-BAgt;NAA，其中，AgNO3的極差最大，對(duì)子葉不定芽的誘導(dǎo)影響最大，是主要因素。

表5 子葉不定芽誘導(dǎo)結(jié)果的直觀分析Table 5 Direct perceiving analysis of induction result of cotyledon adventitious buds

3 討論

在蕓薹屬植物組織培養(yǎng)中，不同激素的濃度及其配比，在不同的報(bào)道中并不完全一致。目前報(bào)道最多的組合是BA+NAA，但適宜濃度因基因型而異。本研究中‘十月鮮’子葉芽誘導(dǎo)最佳激素配比為3.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA，這與前人在甘藍(lán)型油菜[5]、大白菜[6]等蕓薹屬植物中的結(jié)果基本一致；與李漢霞等[3]在紫菜薹中的研究結(jié)果也接近，但本研究培養(yǎng)基中的6-BA、NAA水平略高，這可能是基因型和生理狀態(tài)不同的緣故。許多研究也表明，不同基因型的蕓薹屬植物再生頻率有顯著的差異[7，8]。本研究比較了6個(gè)品種子葉不定芽的誘導(dǎo)頻率，發(fā)現(xiàn)‘十月鮮’紫菜薹不定芽誘導(dǎo)率較高；進(jìn)一步的二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中，‘十月鮮’子葉不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到了85%以上，可以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

自Chi等[9，10]首先發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加AgNO3能顯著促進(jìn)大白菜、白菜和菜心的子葉再生成芽以來(lái)，一般認(rèn)為Ag+是較好的乙烯活性抑制劑，能競(jìng)爭(zhēng)性地作用于乙烯作用部位，防止外植體產(chǎn)生過(guò)多的乙烯對(duì)植株再生的抑制作用[11]。通常認(rèn)為AgNO3對(duì)蕓薹屬植物的再生分化有較大的影響，而且多認(rèn)為適當(dāng)濃度的AgNO3能顯著地提高不定芽的分化頻率[12～20]。本研究結(jié)果與此一致。而且本研究的二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)分析結(jié)果認(rèn)為，AgNO3是影響紫菜薹子葉不定芽誘導(dǎo)的主要因素，在其他蕓薹屬植物中是否如此有待證實(shí)。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)高濃度的AgNO3容易引起黃化現(xiàn)象，這與屈會(huì)玲等[21]在彩色大白菜中的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)紫菜薹不定芽生根較為困難，但生根后移栽較易成活，生根較為困難的原因仍需進(jìn)一步研究。

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2009-12-08

湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2007ABA386)

林小芳(1985-)，女，福建福州人，碩士研究生，主要從事園藝植物生物技術(shù)研究.

劉樂承，E-mail: lchliu18@yangtzeu.edu.cn.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.01.015

Q813.1

A

1673-1409(2010)01-S060-03