瑞林類寡肽抗癌藥物的合成研究進(jìn)展

宋 蕓， 魏紹川,， 王永峰， 焦淑清

(1. 天津天士力集團(tuán)研究院 化學(xué)藥物研究所，天津 300402；2. 佳木斯大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院 黑龍江省生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 佳木斯 154007)

瑞林類藥物的母體是促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing Hormone,簡(jiǎn)稱GnRH)，亦稱黃體生成素釋放激素(Luteinizing Hormone-releasing Hormone,簡(jiǎn)稱LH-RH )，是由下丘腦脈沖式分泌的十肽激素，其氨基酸序列為：焦谷氨酸(pGlu)-組氨酸(His)-色氨酸(Trp)-絲氨酸(Ser)-酪氨酸(Tyr)-甘氨酸(Gly)-亮氨酸(Leu)-精氨酸(Arg)-脯氨酸(Pro)-甘氨酸(Gly)-氨基。將母體GnRH的6-位和10-位Gly進(jìn)行構(gòu)型轉(zhuǎn)換和殘基置換，得到了一系列GnRH激動(dòng)劑，即具有重要臨床價(jià)值的瑞林類寡肽藥物，通式為pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y，其氨基酸序列與構(gòu)型見表1。

瑞林類藥物屬于寡肽類化合物，具有易于吸收、生物利用度高、生物活性強(qiáng)且對(duì)人體無毒副作用等諸多優(yōu)點(diǎn)，臨床在治療前列腺癌、乳腺癌、子宮肌瘤、青春性早熟、子宮內(nèi)膜異位癥和功能性子宮出血等一些激素依賴性疾病[1]上有著顯著療效，其價(jià)格昂貴，市場(chǎng)前景非常廣闊。巨大的經(jīng)濟(jì)效益刺激著人們對(duì)其合成方法的研究和不斷完善。目前，多肽的合成方法主要包括液相合成、固相合成以及液-固聯(lián)用合成，本文簡(jiǎn)要介紹這幾種方法在瑞林類寡肽藥物合成中的應(yīng)用。

表 1 瑞林藥物的氨基酸序列及構(gòu)型Table 1 Sequence and configuration of amino acids in Relin drugs

1 液相合成

液相多肽合成是在溶液中進(jìn)行的化學(xué)合成方法，因其每步中間產(chǎn)物都可以純化、可以隨意進(jìn)行非氨基酸修飾并避免氨基酸缺失等優(yōu)點(diǎn)而成為短肽合成的首選方法。采用液相合成法已經(jīng)成功合成了多個(gè)瑞林藥物。

1.1 氨基、羧基及側(cè)鏈官能團(tuán)的保護(hù)

氨基酸作為肽合成的基本單元，含有氨基、羧基及某些活潑的側(cè)鏈基團(tuán)，為確保反應(yīng)定向進(jìn)行及減少副反應(yīng)的發(fā)生，不參與反應(yīng)的活性基團(tuán)在接肽反應(yīng)時(shí)必須處于被保護(hù)狀態(tài)。以戈舍瑞林(1， Chart 1)為例，合成中所用到的氨基酸有pGlu, His, Trp, Ser, Tyr, D-Ser, Leu, Arg及Pro，文獻(xiàn)中對(duì)這些氨基酸的氨基、羧基及活潑側(cè)鏈的保護(hù)如表2所示。

1.2 短肽片段的合成

氨基酸的活性基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)后，前一個(gè)氨基酸分子裸露的羧基和下一個(gè)氨基酸分子裸露的氨基在溶液中可以定向形成酰胺鍵。文獻(xiàn)所用到的瑞林藥物的接肽方法主要有碳二亞胺法、混合酸酐法、活化酯法和疊氮物法。這幾種方法經(jīng)常交叉混合使用于同一個(gè)瑞林藥物不同短肽片段的合成中。下面僅以二肽 pGlu-His 的合成為例簡(jiǎn)要介紹這幾種方法的具體操作。

(1) 碳二亞胺法[4]： 將pGlu和His-OMe·2HCl懸浮在DMF中，攪拌下于-5 ℃加入三乙胺和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，反應(yīng)2 h后室溫反應(yīng)過夜得保護(hù)二肽pGlu-His-OMe。

(2) 混合酸酐法[11]： 將Z-pGlu溶解在THF中，冷卻至-20 ℃時(shí)加入N-甲基嗎啉(NMM)和氯甲酸異丁酯，攪拌反應(yīng)1 min得混合酸酐，加N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)反應(yīng)30 min后再加入His-OH·HCl和三乙胺的水溶液，于0 ℃反應(yīng)1 h后室溫反應(yīng)過夜得保護(hù)二肽Z-pGlu-His。

(3) 活化酯法[2]： 將等摩爾的His-OH·HCl和Na2CO3溶解在水和DMF的混合溶劑中，攪拌下于室溫加入Z-pGlu-ONB的二氧六環(huán)溶液，反應(yīng)14 h得保護(hù)二肽Z-pGlu-His。

(4) 疊氮物法[10]： 均以氨基酸酯或肽羧酸酯為起始原料。pGlu-His-OMe和99%水合肼溶解在甲醇中，攪拌下于10 ℃反應(yīng)1 h后室溫反應(yīng)過夜得pGlu-His-NHNH2。 0 ℃將其溶解在干燥的 DMF和DMSO的混合溶劑中，加入無水HCl的THF溶液。冷卻至-20 ℃時(shí)加入亞硝酸異戊酯，反應(yīng)30 min后再冷卻至-24 ℃，緩慢滴加三乙胺調(diào)節(jié)體系的pH 8～9。于-20 ℃加入Trp-OBzl的干燥DMF溶液，反應(yīng)30 min后于0 ℃反應(yīng)18 h得保護(hù)三肽pGlu-His-Trp-OBzl。

1.3 保護(hù)基的脫除

通過以上方法得到的保護(hù)短肽片段，只有脫除氨基或羧基保護(hù)基后，才能和另一個(gè)氨基酸或短肽片段進(jìn)行下一步接肽反應(yīng)以增長(zhǎng)肽鏈。從表2可以看出，瑞林類寡肽原料藥的合成所用到的氨基保護(hù)基主要是芐氧羰基(Cbz)和叔丁氧羰基(Boc)。其中包含有Arg(NO2或Tos)的肽片段，如果需要保持側(cè)鏈保護(hù)基，則用HBr/AcOH體系處理以脫去Cbz[6,15,16]，而其余氨基酸的Cbz則用5%Pd/C催化氫化脫除。Boc-Arg[8]保護(hù)基的脫除是在室溫下用3 mol·L-1HCl在乙酸乙酯中反應(yīng)，其余Boc的脫除則在冰浴下用少量三氟乙酸處理[4]。

對(duì)于羧基保護(hù)基的脫除，His(Bzl)-OBzl[3]和Trp-OBzl[9,10]中芐酯保護(hù)基采用5%Pd/C催化氫化進(jìn)行；除Arg(NO2)-OMe[14]之外，其余肽甲酯的脫除則用1 mol·L-1NaOH室溫進(jìn)行皂化[5,7,13]；而大部分羧基保護(hù)基則在水合肼、HCl 和亞硝酸異戊酯等的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榀B氮化物[4,6,8,9,11～14]，而后

用于下一步接肽反應(yīng)。

瑞林類寡肽的合成所用到的側(cè)鏈保護(hù)基的脫除大都采用催化還原法，如 His(Bzl)[3]， Tyr(Bzl)[8,14]和Arg(NO2)[8,11]的側(cè)鏈保護(hù)基均采用Pd/C催化氫化脫除，而Arg(Cbz2)[14]則采用Pd/BaSO4在甲醇中催化氫化脫除側(cè)鏈保護(hù)基。Arg(Tos)[11]中側(cè)鏈保護(hù)基Tos則用HF/苯甲醚體系脫除。

需要指出的是，側(cè)鏈保護(hù)基與α-氨基保護(hù)基的選擇必須符合正交保護(hù)策略，即α-氨基保護(hù)基的脫除條件要盡量遠(yuǎn)離脫除側(cè)保護(hù)的條件，以便在肽鏈縮合的過程中保持側(cè)鏈保護(hù)基的完整性。

1.4 瑞林類寡肽藥物的合成

將氨基酸的活性基團(tuán)進(jìn)行合理保護(hù)后，可以通過溶液中的逐個(gè)增長(zhǎng)肽鏈法和片段縮合法合成瑞林類寡肽藥物。

逐個(gè)增長(zhǎng)肽鏈法[18]： 從肽鏈的羧端氨基酸Gly開始，依次和Boc或Cbz保護(hù)氨基酸在DCC作用下逐步向氨端增長(zhǎng)肽鏈，直至側(cè)鏈保護(hù)的戈那瑞林的生成。

Chart1

表 2 合成戈舍瑞林所用氨基酸活性基團(tuán)的保護(hù)*Table 2 Protection of active groups of amino acids in the synthesis of goserelin

*-：無保護(hù)基； Cbz：芐氧羰基； Boc： 叔丁氧羰基； Bzl： 芐基； Tos: 對(duì)甲苯磺酰基; Trt: 三苯甲基； Mtr: 4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基

片斷縮合法： 是指在溶液中將幾個(gè)預(yù)先合成的短肽片斷連接起來。文獻(xiàn)報(bào)道的片段縮合方式主要有2+8[19]， 3+7[14,20]， 4+6[8,17,21,22]， 5+5[7,23,24]以及6+3[25]。其中一個(gè)典型的4+6[17]片段縮合合成戈舍瑞林的路線如Scheme 1所示。

首先液相合成保護(hù)二肽pGlu-His-OMe和Trp-Ser-OMe及保護(hù)三肽Cbz-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-OMe和Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2，然后分別采用疊氮物法合成保護(hù)的四肽(2+2)及六肽(3+3)片段。脫除六肽的氨基保護(hù)基及精氨酸側(cè)鏈胍基保護(hù)基后和四肽片段重復(fù)采用疊氮物法合成十肽戈舍瑞林。需要指出的是，除本例采用的疊氮物法外，碳二亞胺法、混合酸酐法和活化酯法也適用于片段縮合合成瑞林化合物。

在液相合成瑞林藥物的過程中，每次接肽反應(yīng)后都需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化以除去未反應(yīng)的原料和副產(chǎn)物，步驟冗長(zhǎng)且麻煩，因操作帶來的損失也很大。早在1971年，A V Schally等[27]采用固相方法合成了第一個(gè)GnRH 類似物，由于此方法使多肽合成實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，只在最后一步進(jìn)行分離純化，省時(shí)省力，基于其優(yōu)點(diǎn)固相肽合成也已經(jīng)廣泛應(yīng)用于瑞林類寡肽藥物的合成中。

pGlu-His-OMe+Trp-Ser-OMe Cbz-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-N3(3)+Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2(3)

pGlu-His-Trp-Ser-OMe(4) Cbz-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2

pGlu-His-Trp-Ser-N3+ Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2·HCl

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2(1)

Scheme1

Scheme2

2 固相合成法

固相肽合成的反應(yīng)過程如Scheme 2所示。先將所要合成肽鏈的末端氨基酸的羧基共價(jià)鍵合到一個(gè)不溶性的高分子樹脂上，然后脫去此氨基酸的氨基保護(hù)基，以此為氨基組分同過量的活化羧基組分反應(yīng)以接長(zhǎng)肽鏈。這樣的步驟重復(fù)多次至目標(biāo)肽的生成，即縮合→洗滌→去保護(hù)→中和、洗滌→下一輪縮合。根據(jù)α-氨基保護(hù)基的不同，目前合成瑞林類寡肽藥物的固相方法主要分為Boc法，F(xiàn)moc(芴甲氧羰基)法以及兩者的結(jié)合，下面對(duì)這三種方法所用到的固相載體、縮合方法，α-氨基以及側(cè)鏈保護(hù)基及脫保護(hù)基的條件、肽從樹脂上脫除方法等方面進(jìn)行總結(jié)。

2.1 Boc法

Boc法是指所有參與反應(yīng)的氨基酸其α-氨基均采用Boc進(jìn)行保護(hù)，其羧基活化后(已報(bào)道的瑞林類寡肽的Boc法固相合成，羧基均采用DCC活化)與樹脂末端裸露的氨基組分進(jìn)行接肽反應(yīng)。每一步接肽反應(yīng)完成后，在中強(qiáng)酸作用下脫除Boc保護(hù)基，使α-氨基裸露出來以便進(jìn)行下一步接肽反應(yīng)。

為了確保反應(yīng)的定向進(jìn)行及減少副反應(yīng)，活潑的側(cè)鏈基團(tuán)必須進(jìn)行保護(hù)。側(cè)鏈保護(hù)基的選擇原則仍需符合正交保護(hù)策略，即其脫除條件必須遠(yuǎn)離脫除Boc的中強(qiáng)酸條件，以便在肽鏈形成的過程中保持側(cè)鏈保護(hù)的完整性。表3列出了文獻(xiàn)報(bào)道的瑞林類寡肽藥物固相Boc法合成中所用的樹脂、脫Boc條件、側(cè)鏈保護(hù)基及其脫除方法以及寡肽從樹脂上的切割方法等。從表3可以看出，固相合成瑞林類寡肽藥物中，Boc的脫除均采用了三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷(DCM)和1 mol·L-1HCl/AcOH的中強(qiáng)酸條件。肽鏈從二苯甲胺樹脂上切割采用了HF/苯甲醚體系的酸裂解法，從聚苯乙烯/二乙烯基苯交聯(lián)樹脂和氯甲基樹脂上的切割則采用了氨解的方法。接肽反應(yīng)完成后，所有的側(cè)鏈保護(hù)基的脫除和肽鏈的切割同時(shí)進(jìn)行或者切割后一步脫除。

表 3 固相Boc法合成瑞林類寡肽藥物 Table 3 Solid phase Boc methods for the synthesis of Relin drugs

a． 和肽鏈從樹脂上脫除時(shí)一起脫掉； b． 用HF在苯甲醚(20%)中脫去(0 ℃)； c． 氨解； d. 1 mol·L-1

表 4 固相Fmoc法合成瑞林類寡肽藥物Table 4 Solid phase Fmoc methods for the synthesis of Relin drugs

a．V(TFA) ∶V(DCM)=2 ∶98; b． TFA/TIS/H2O/EDT溶液，室溫反應(yīng)2 h; c． 5%Pd/C； d. AcOH/TFE/DCM

以文獻(xiàn)[34]方法為例說明固相Boc法合成曲普瑞林的實(shí)驗(yàn)過程：將二苯甲胺樹脂放在反應(yīng)器中，按如下順序洗滌：(a)DCM； (b)33%TFA/DCM洗兩次； (c)DCM； (d)乙醇； (e)氯仿； (f)10%TFA/氯仿洗兩次，每次25 min； (g)氯仿； (h)DCM。洗過的樹脂和Boc-Gly在二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作用下于DCM中室溫反應(yīng)2 h，而后用DCM，乙醇和DCM分別洗樹脂三次。再用33%TFA/DCM體系脫保護(hù)，而后重復(fù)c～h洗滌步驟。采用如上相同的方法依次連接下面的氨基酸：Boc-Pro； Boc-Arg(Tos)； Boc-Leu； Boc-D-Trp； Boc-Tyr(2-Br-Cbz)； Boc-Ser(Bzl)； Boc-Trp； Boc-His(Tos)和pGlu。所得到的十肽-樹脂用DCM和甲醇分別洗三次，減壓干燥；于20%的HF/苯甲醚中0 ℃反應(yīng)30 min，肽鏈從樹脂上脫落的同時(shí)側(cè)鏈保護(hù)基全部脫除，分離純化得曲普瑞林。

2.2 Fmoc法

所有參與反應(yīng)的氨基酸，其α-氨基均采用Fmoc進(jìn)行保護(hù)，其羧基活化后與樹脂末端裸露的氨基組分進(jìn)行接肽反應(yīng)。每一步接肽反應(yīng)完成后，F(xiàn)moc均采用20%的哌啶/DMF進(jìn)行脫除。為確保肽鏈形成過程中側(cè)鏈保護(hù)的完整性，側(cè)鏈保護(hù)基的脫除條件也必須遠(yuǎn)離脫除Fmoc的堿性條件。表4列出了文獻(xiàn)報(bào)道的瑞林類寡肽藥物固相Fmoc法合成中所用的樹脂、接肽條件、側(cè)鏈保護(hù)基及其脫除方法以及寡肽從樹脂上的切割方法等。從表4 可以看出，F(xiàn)moc固相合成瑞林藥物，接肽反應(yīng)采用了RCO2Bt活化酯中間體，肽鏈從樹脂上的切割均采用酸裂解方式。接肽反應(yīng)完成后，所有的側(cè)鏈保護(hù)基的脫除和肽鏈的切割同時(shí)進(jìn)行或者切割后一步脫除。

2.3 Boc和Fmoc聯(lián)用法

C F Hayward[40]采用了Boc和Fmoc聯(lián)用法成功合成了1。首先將Boc-Pro連接到聚苯乙烯/二乙烯基苯交聯(lián)樹脂上，用45%TFA/DCM溶液脫Boc保護(hù)基，同時(shí)采用HOBt和DIPC(二異丙基亞胺)在DMF中將Boc-Arg(HCl)-OH和Boc-Leu-OH的羧基活化為苯并三唑酯，然后依次和脫Boc保護(hù)基后的氨基進(jìn)行接肽反應(yīng)得到Boc-Leu-Arg(HCl)-Pro-樹脂。其余氨基酸的α-氨基采用Fmoc保護(hù)，其羧基用HOBt活化，然后按如下順序Fmoc-D-Ser(But)-OH， Fmoc-Tyr(BrCbz)-OH， Fmoc-Ser-OH， Fmoc-Trp-OH， Fmoc-His(Fmoc)-OH， pGlu-OH依次連接到肽-樹脂上。其中Fmoc保護(hù)基的脫除采用20%哌啶/DMF溶液。所得到的九肽-樹脂和20倍過量的無水肼/DMF室溫反應(yīng)24 h可使肽從樹脂脫落，并同時(shí)除去Tyr的側(cè)鏈保護(hù)基Br-Cbz，得九肽pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHNH2，再和氰酸鉀在水/乙酸的混合溶劑中反應(yīng)得到終產(chǎn)物1。

E Nicolás等[41]還采用類Merrifield樹脂從碳端開始前四個(gè)氨基酸[Pro， Arg(Mtr)， Leu和D-Leu]采用Boc法，后四個(gè)氨基酸[Tyr(But)， Ser(But)， Trp和His(Trt)]采用Fmoc法依次連接，最后和pGlu連接后使用乙胺液體從樹脂上切割下來得亮丙瑞林。

3 液-固聯(lián)用法

無論是單用液相還是固相合成寡肽藥物，均存在著方法上的缺陷。液相合成步驟繁瑣冗長(zhǎng)，耗時(shí)費(fèi)力，而固相合成需使用大量的洗脫溶劑，最后的分離純化困難。因此發(fā)展了液-固聯(lián)用法，并且此方法也已經(jīng)成功應(yīng)用于瑞林類寡肽藥物的合成中。

其中一個(gè)成功的例子是內(nèi)源性戈那瑞林的合成[42]。先采用Boc固相合成法將Boc-Gly， Boc-Pro， Boc-Arg(NO2)和Boc-Leu在2,2′-聯(lián)吡啶二硫化物和三苯基磷作用下依次連接到羥甲基樹脂上，得四肽Boc-Leu-Arg(NO2)-Pro-Gly-樹脂。同時(shí)采用傳統(tǒng)的液相合成法合成短肽片段Boc-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-OH和Boc-His(Tos)-Trp-OH，再采用固相接肽法依次將這兩個(gè)短肽片段連接到四肽-樹脂上得側(cè)鏈保護(hù)的九肽-樹脂。用 Na/液氨除去所有的側(cè)鏈保護(hù)基，再用HF/苯甲醚將九肽從樹脂上切割下來后，同羧基活化的pGlu-OPcp液相反應(yīng)得戈那瑞林。該文另一種液-固聯(lián)用法合成戈那瑞林是先將Glu連接到氯甲基甲?；瘶渲希瑫r(shí)采用液相法合成短肽片段H-His-Trp-Ser(But)-Tyr-Gly-OBut和H-Leu-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2。樹脂-Glu-OBut和三倍量的短肽片段在2,2′-聯(lián)吡啶二硫化物和三苯基磷作用下進(jìn)行固相片段接肽合成樹脂-十肽，用HF/苯甲醚將肽從樹脂上切割下來并脫除側(cè)鏈保護(hù)基后，Glu環(huán)化即得到戈那瑞林。

最近，上海吉爾生化的朱琦等[43]以Arg(pbf)-Trt(2-Cl)-Cl樹脂為起始原料，在 DIC(1 eq)和HOBt作用下在DMF溶液中將Fmoc保護(hù)氨基酸依次連接，得全保護(hù)八肽pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(But)-Tyr(But)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-樹脂，再用1%的TFA/DCM溶液將肽鏈切割下來。同時(shí)，Boc-Pro在THF中和NMM，氯甲酸乙酯及乙胺反應(yīng)，經(jīng)2 mol·L-1HCl/二氧六環(huán)脫Boc得H-Pro-NHEt·HCl，而后和全保護(hù)八肽在DMF中，在HOBt和NMM或DIEA及DIC或BOP作用下生成側(cè)鏈保護(hù)的九肽，一步脫除側(cè)鏈保護(hù)基得到亮丙瑞林粗品。

4 結(jié)束語

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)GnRH類似物的年需求量在50 kg左右，并以15%的年增長(zhǎng)率增長(zhǎng)。由于受合成技術(shù)的限制，幾種具有廣闊市場(chǎng)前景的瑞林原料藥在國(guó)內(nèi)尚不能夠進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，用于制劑研究的原料藥需要進(jìn)口，這極大制約了瑞林類藥品的國(guó)產(chǎn)化。瑞林藥物90%以上的市場(chǎng)由外資企業(yè)所控制，中國(guó)產(chǎn)品幾乎為零，所以該類藥品價(jià)格昂貴。鑒于此，本文在查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)瑞林類藥物已有的合成方法進(jìn)行了歸納總結(jié)，希望以此推動(dòng)瑞林類原料藥在國(guó)內(nèi)早日實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。

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