氫氯噻嗪在Caco-2細胞模型中的體外轉(zhuǎn)運研究

廖曉歡，王俊俊，韓鳳梅，杜鵬，陳勇

(湖北大學(xué) 中藥生物技術(shù)湖北省重點實驗室，武漢 430062)

氫氯噻嗪(hydrochlorothiazide)是臨床上廣泛應(yīng)用的口服利尿藥和抗高血壓藥，它通過抑制腎小管對鈉和水的再吸收，減少血容量和細胞外液量，降低心輸出量，達到降壓作用[1].Caco-2細胞(the human colon adenocarcinoma cell lines)來源于人類結(jié)腸癌細胞,與人小腸上皮細胞形態(tài)相似.Caco-2細胞模型是進行藥物腸道攝取和代謝研究最常用的體外細胞模型[2-3].目前，還少見關(guān)于氫氯噻嗪在Caco-2細胞模型體外轉(zhuǎn)運的研究報道.本實驗運用Caco-2細胞模型，研究轉(zhuǎn)運時間、藥物濃度、P-gp抑制劑維拉帕米(verapamil)和pH對氫氯噻嗪跨膜轉(zhuǎn)運的影響，探討氫氯噻嗪的體外吸收機制，以期為含有氫氯噻嗪的中藥復(fù)方吸收機制提供參考.

1 儀器與試劑

Olympus XDS-1B型倒置顯微鏡，Sigma公司2K15C型低溫高速離心機，上海迅達醫(yī)療儀器公司XD-711型酶標儀，島津UV-1601紫外分光光度計，Heal Forse CO2培養(yǎng)箱，Millipore公司Millicell-ERS型跨膜電阻儀，Agilent 1100 Series高效液相色譜儀(包括DAD二極管陣列檢測器；Agilent ChemStation色譜工作站)，韓國Biotron公司真空離心濃縮機，美國Costar公司Transwell細胞培養(yǎng)板，Millipore公司millicell膜.

氫氯噻嗪(HCTZ，批號100309-200001，純度>98%)、維拉帕米(Ver，批號100223-200102，純度>98%)購于中國藥品生物制品檢定所；DMEM培養(yǎng)基購于Gibico公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；非必需氨基酸購于Sigma公司；胰酶、青霉素-鏈霉素購于吉諾生物有限公司；堿性磷酸酶試劑盒購于南京建成生物有限公司；色譜純乙腈購于美國Fisher公司.Caco-2細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，實驗所用的細胞傳代數(shù)為25～60代.

2 方法

2.1細胞單層模型建立Caco-2細胞培養(yǎng)于37 ℃，含5%CO2的環(huán)境中，采用DMEM培養(yǎng)基，其中含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺以及青霉素-鏈霉素雙抗液.

隔天換一次培養(yǎng)液，每3 d按1∶3的比例傳代.將對數(shù)生長期細胞按1×105個·mL-1接種到12孔Transwell板上，接種后隔天換液，7 d后每日換液，培養(yǎng)至21 d.參照文獻方法[4]，檢測堿性磷酸酶活性和各孔跨膜電阻(跨膜電阻值大于400 Ω·cm-2)，選擇Caco-2細胞單層生長狀態(tài)完好、符合轉(zhuǎn)運條件的Millicell膜用于轉(zhuǎn)運實驗.

2.2 HCTZ的跨膜轉(zhuǎn)運實驗根據(jù)MTT的實驗結(jié)果，用pH7.4 Hank’s緩沖鹽溶液(HBSS溶液)配制濃度為100、200、500 mg·L-1的HCTZ溶液，過濾除菌.取符合轉(zhuǎn)運條件且細胞生長狀態(tài)完好的Millicell膜，用37 ℃預(yù)熱的空白pH7.4 HBSS溶液清洗細胞單層3次(此步驟在30 min內(nèi)完成)，之后放入37 ℃CO2恒溫培養(yǎng)箱30 min.A→B側(cè)的轉(zhuǎn)運：將0.5 mL各濃度的藥物溶液加到細胞絨毛面Apical(A)側(cè)作為供給池，同時基底面Basolateral(B)側(cè)加入1.5 mL空白的HBSS溶液作為接受池.B→A側(cè)的轉(zhuǎn)運：將1.5 mL各濃度的藥物溶液加到B側(cè)作為供給池，同時A側(cè)加入0.5 mL空白HBSS溶液作為接受池.分別于30，60，90，120 min從接受池中取樣0.5 mL(A→B側(cè)的轉(zhuǎn)運)或0.2 mL(B→A側(cè)的轉(zhuǎn)運)，同時補加等量空白HBSS溶液.用HPLC測定藥物的吸收量，分別考察轉(zhuǎn)運時間、濃度、pH值、P-gp抑制劑Ver對HCTZ吸收與轉(zhuǎn)運的影響.

2.3 HCTZ定量分析條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil DOS-P(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為乙腈∶水(17∶83)；流速1.0 mL·min-1；檢測波長270 nm；進樣量20 μL；柱溫25 ℃.

2.3.2 樣品前處理方法 取轉(zhuǎn)運樣品在4 ℃，12 000 g條件下高速離心10 min，取上清于37 ℃真空離心濃縮揮干，用流動相200 μL復(fù)溶后渦旋震蕩1 min，再于4 ℃，12 000 g離心10 min，取上清液20 μL進樣檢測.

2.4數(shù)據(jù)處理表觀滲透系數(shù)Papp(apparent permeability coefficients)代表藥物轉(zhuǎn)運能力的大小，Papp=(dQ/dt)/(A×C0) cm·s-1[5]

其中，dQ/dt為單位時間藥物轉(zhuǎn)運量(μg·min-1)，

A為聚碳酯膜的表面積(此實驗中為1.13 cm2)，

C0為HCTZ的初始濃度(mg·L-1).

由于每次取樣后都要補液，對藥物的通透產(chǎn)生了稀釋作用，因而要對藥物的累積吸收濃度TRcum(mg·L-1)進行校正，

其中An為第n個樣品通透量的測定值，VSn為第n個樣品的采樣體積，VR為接受池體積.

3 結(jié)果

3.1 HCTZ的HPLC分析方法在本色譜條件下，空白HBSS溶液對HCTZ的檢測無干擾，色譜分離良好.精密稱取HCTZ對照品適量，用空白HBSS液制成質(zhì)量濃度分別為0.15、0.5、2、4、8、15 mg·L-1對照品溶液，所得系列對照品溶液按“2.3.2”項操作后進樣.以HCTZ色譜峰面積為橫坐標，濃度為縱坐標進行線性回歸，得到標準曲線為y=0.021 9x-0.192 1，r=0.999 6，線性范圍為0.15～15 mg·L-1.

配制HCTZ0.2 mg·L-1、2 mg·L-1、15 mg·L-1質(zhì)控濃度的HBSS溶液，分別進樣測定峰面積，計算藥物質(zhì)量濃度，以測得的質(zhì)量濃度與實際質(zhì)量濃度相比較，求得方法回收率為98.52%～102.01%.每樣本測定6次，連續(xù)測定3 d，HCTZ的日內(nèi)精密度和日間精密度均小于5%.

3.2 HCTZ的跨膜轉(zhuǎn)運

3.2.1 時間及濃度對HCTZ轉(zhuǎn)運的影響 不同濃度HCTZ通過Caco-2細胞單層膜型的累積轉(zhuǎn)運濃度隨時間變化的結(jié)果見表1.HCTZ3個作用濃度A→B方向的轉(zhuǎn)運量在前90 min隨作用時間的延長基本增加，低、中兩個作用濃度B→A方向的轉(zhuǎn)運量前90 min隨作用時間的延長而降低.

表1 HCTZ在Caco-2細胞中的累積吸收濃度(n=3，±s) mg·L-1

根據(jù)公式Papp=(dQ/dt)/(A×C0) cm·s-1，計算出HCTZ在120 min時的表觀滲透系數(shù)，結(jié)果見表2.結(jié)果表明，HCTZPappA→B隨濃度的升高而降低，且不同濃度下PappB→A/PappA→B值均大于1.5.

表2 HCTZ在Caco-2細胞中的表觀滲透系數(shù)(n=3，±s)

*與HCTZ 100 mg·L-1比較，P<0.05.

3.2.2 Ver對HCTZ轉(zhuǎn)運的影響 Ver對HCTZ的表觀滲透系數(shù)Papp的影響結(jié)果見表3.Ver能極顯著增加HCTZ通過Caco-2單層細胞模型的PappA→B(P<0.01)，減少HCTZ通過Caco-2單層細胞模型的Papp B→A，Papp B→A/PappA→B從加入前的2.81下降到加入后的0.67，有極顯著性差異(P<0.01).

表3 Ver對HCTZ轉(zhuǎn)運的影響(n=3，±s)

**與HCTZ組比較，P<0.01.

3.2.3 pH值對HCTZ轉(zhuǎn)運的影響 pH值對HCTZ轉(zhuǎn)運的影響結(jié)果見表4.在pH6.0條件下，PappA→B是pH7.4條件下的3.9倍，有極顯著性差異(P<0.01)；同時，Papp B→A是pH7.4條件下的53%，結(jié)果亦有顯著性差異(P<0.05).

表4 pH對HCTZ轉(zhuǎn)運的影響(n=3，±s)

*與pH7.4組比較，P<0.05；**與pH7.4組比較，P<0.01.

4 討論

通過測定不同濃度受試藥物的表觀滲透系數(shù)可以確定藥物的轉(zhuǎn)運機制.若在整個質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(于漏槽條件下)測得Papp值保持恒定，則被動擴散為主要轉(zhuǎn)運機制；若Papp A→B與Papp B→A相同也可確定被動擴散為主要轉(zhuǎn)運機制，若Papp B→A/PappA→B>1.5，則提示可能存在主動轉(zhuǎn)運機制[6].HCTZ 100 mg·L-1與200 mg·L-1以及100 mg·L-1與500 mg·L-1時的PappA→B均有顯著性差異(P<0.05)，因此，HCTZ在整個濃度范圍內(nèi)的表觀滲透系數(shù)不是恒定不變的，且在整個濃度范圍內(nèi)HCTZ的Papp B→A/PappA→B>1.5，表明HCTZ在Caco-2細胞內(nèi)可能存在主動轉(zhuǎn)運機制.同時，Papp A→B值隨HCTZ濃度的增加而逐漸減小，這可能與Caco-2細胞的轉(zhuǎn)運載體有限有關(guān).

P-糖蛋白是由多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)基因編碼的分子量為170×103的膜蛋白，存在于細胞層的絨毛面一側(cè)，系一種能量依賴性的藥物外排泵[7].P-糖蛋白存在于Caco-2細胞AP 面的細胞膜上，它將細胞內(nèi)的HCTZ作為底物排出細胞外，使得A→B的轉(zhuǎn)運速率減慢，而B→A的轉(zhuǎn)運速率增大.Ver是P-糖蛋白的專屬抑制劑.本實驗在加入Ver后，基本抑制了P-gp對HCTZ的外排作用，使HCTZPappA→B值極顯著增大，轉(zhuǎn)運加快，而Papp B→A降低，轉(zhuǎn)運減慢，說明HCTZ可能是P-gp的作用底物.

HCTZ屬于弱酸性物質(zhì)，在pH6.0條件下，HCTZ大量以非解離的(脂溶性)的形式存在，由于消化道上皮細胞具有脂質(zhì)膜的功能，只允許脂溶性的非解離的酸或堿通過，酸性藥物在酸性條件下吸收較強.因此，HCTZ在pH6.0條件下的吸收較pH7.4時有顯著提高.

綜合上述實驗結(jié)果，我們推測HCTZ在Caco-2細胞模型中的吸收可能存在由載體介導(dǎo)的主動轉(zhuǎn)運，同時它還受到P-gp的外排作用.

參考文獻：

[1] 張宗任,郎九立.不同劑量的氫氯噻嗪對原發(fā)性高血壓的治療研究[J].中國實用醫(yī)藥,2008,3(9):47.

[2] Ingels F,Deferme S,Destexhe E,et al.Simulated inestinal fluid as transport medium in the Caco-2 cell culture model[J].International Journal of Pharmaceutics,2003,232(1):183-292.

[3] Allen R H,Rpbert A C,Philip S B.Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa[J].Pharm Res,1990,7(9):902-910.

[4] 楊秀偉,楊曉達,王瑩,等.中藥化學(xué)成分腸吸收研究中Caco-2細胞模型和標準操作規(guī)程建立[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報,2007,5(6):634-641.

[5] 宋麗,張寧,徐德生.芍藥苷在Caco-2細胞模型中吸收機制的研究[J].中草藥,2008,39(1):41-44.

[6] Artursson P,Karlsson J.Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial(Caco-2) cells[J].Biochem Biophys Res Commun,1991,175(3):880-885.

[7] Haber B A,Mohn K L,Diamond R H,et al.Induction patterns of 70 genes during nine days after hepaterctomy define the temporal course of liver regeneration[J].J Clin Invest,1993,91:1319-1341.