目安眼膏抗單純皰疹病毒的最佳濃度研究

張湘暉王 適 何 群伍參榮譚涵宇姜 宇趙碧清張 健

2湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二中醫(yī)臨床學(xué)院

3湖南中醫(yī)藥大學(xué)

阿昔洛韋（acyclovir，ACV）是治療單純皰疹病毒性角膜炎（HSK）的首選藥物，但ACV對角膜修復(fù)、愈合及再生能力欠佳，單純應(yīng)用很難控制病毒抗原引起的免疫性炎癥反應(yīng)。前期研究發(fā)現(xiàn)〔1-3〕，蜂蜜與ACV配伍制成的目安眼膏，既能增強(qiáng)治療HSK的藥效，又能提高角膜修復(fù)、愈合及再生能力，但藥效與蜂蜜濃度密切相關(guān)。為進(jìn)一步驗(yàn)證前期研究成果，討論5%蜂蜜是否為最佳濃度，本實(shí)驗(yàn)采用透射電鏡觀察含0%、3%、5%、7%蜂蜜的目安眼膏與市售阿昔洛韋眼膏（不含蜂蜜）的作用效果，為目安眼膏處方設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康成年新西蘭大白兔由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動物科技服務(wù)部提供，雌雄各半，體重2.00～2.50 kg，共 28只（56眼），健康無眼疾（動物合格證號scxk（湘）2006-0001）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及設(shè)備

Hela細(xì)胞（湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心）；0.1 mol/L磷酸緩沖液（PBS）、2.5%戊二醛固定液（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院電鏡室）。生理鹽水（武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，080421405）；熒光素鈉（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一中醫(yī)臨床學(xué)院藥劑科）；表面麻醉劑（0.4%Benoxil溶液，日本參天制藥株式會社）；3%阿昔洛韋眼膏（上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號080301）；紫云英蜂蜜（湖南省藥材公司，經(jīng)我院周日寶教授鑒定符合《中國藥典》2005版第一部規(guī)定）；阿昔洛韋（湖北科益藥業(yè)股份有限公司）；目安眼膏：采用蜂蜜與阿昔洛韋為主要成分，加入眼膏凝膠基質(zhì)配制而成；卡波姆－940、吐溫－80、司盤－80、尼泊金乙醋，甘油，氫氧化鈉，蒸餾水，皆符合藥用規(guī)格。透射電鏡：H-600 型（日本 HⅠTACHⅠ公司）。

1.3 毒株

單純皰疹Ⅰ型病毒株由湖南中醫(yī)藥大學(xué)微生物免疫學(xué)教研室提供，在非洲綠猴腎細(xì)胞中傳代。造模所用的 HSV-1的半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（TCⅠD50）是 10-5.61。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動物造模

參照角膜環(huán)鉆壓痕法〔4〕及上皮劃痕法〔5〕。 操作：0.5%地卡因表面麻醉，6 mm環(huán)鉆在角膜中央作一壓痕，并在其壓痕內(nèi)作“#”劃痕（深度僅限上皮層），微量取樣品25 μl病毒懸液，滴入兔雙眼結(jié)膜囊內(nèi)，閉合眼瞼并按摩1分鐘，接種48小時(shí)后觀察，動物均有畏光、流淚、角膜出現(xiàn)點(diǎn)狀、樹枝狀和地圖樣著色及角膜基質(zhì)深淺不一的水腫混濁，提示造模成功。

1.4.2 動物分組

按兔眼病情輕重分層，采用隨機(jī)對照表法將模型兔隨機(jī)分為7組，每組4只（8眼）。即：Ⅰ組：含0%蜂蜜和3%ACV目安眼膏組；Ⅱ組：含3%蜂蜜和3%ACV目安眼膏組；Ⅲ組：含5%蜂蜜和3%ACV目安眼膏組；Ⅳ組：含7%蜂蜜和3%ACV目安眼膏組；Ⅴ組：模型組（陰性對照組）；Ⅵ組：市售3%阿昔洛韋眼膏組（陽性對照組）；Ⅶ組：凝膠基質(zhì)組（空白組）。

1.4.3 給藥方法〔5〕

每日涂眼藥3次，每次給藥約0.1 g，間隔4小時(shí)（8時(shí)、12時(shí)、16時(shí)），雙眼接受同樣治療，共 12天。每次給藥前生理鹽水沖洗5分鐘，保證水的流量和流速都不會導(dǎo)致眼損傷。

1.4.4 電鏡觀察

用藥后第9天，分別從7組中抽取一只兔（取角膜病變接近平均計(jì)分）〔6〕，生理鹽水沖洗結(jié)膜囊分泌物和染色劑，兔夾子固定兔，空氣栓塞法處死〔7〕。摘取角膜，電鏡觀察。步驟〔8〕：沿角膜緣剪下角膜放入2.5%戊二醛中進(jìn)行前固定，0.1 mol/L PBS漂洗，1%鋨酸后固定，0.1 mol/L PBS漂洗，丙酮梯度脫水（50%、70%、90%、100%），Epon812環(huán)氧樹脂包埋與100%丙酮1∶1比例浸泡，Epon812環(huán)氧樹脂浸泡、包埋，瑞典LKB公司11880型修塊機(jī)修塊定位，醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察、拍片、記錄。

2 結(jié)果

用藥后第9天，通過透射電鏡觀察可見：

Ⅰ組：角膜上皮表面微絨毛脫落，上皮細(xì)胞間隙增寬，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分輕度擴(kuò)張，線粒體嵴丟失（圖1）?；|(zhì)層結(jié)構(gòu)排列疏松，纖維細(xì)胞典型空泡變，線粒體腫脹，染色質(zhì)邊集，組織間隙水腫（圖2）。

Ⅱ組：角膜上皮表面微絨毛基本消失，可見上皮細(xì)胞核輪廓，細(xì)胞間橋粒松解、破壞，空泡化不明顯，細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，胞核開始裂解（圖3）。基質(zhì)層形成調(diào)亡小體形成（圖4）。細(xì)胞層次可見3～4層上皮細(xì)胞核，細(xì)胞間連接模糊，染色質(zhì)邊集，胞漿局部空泡，細(xì)胞核腫脹（圖5）。

Ⅲ組：角膜上皮表面微絨毛豐富，細(xì)胞層次有7～8層排列規(guī)則、相互重疊的扁圓形細(xì)胞核，核形較規(guī)則，染色質(zhì)部分邊集，細(xì)胞器發(fā)達(dá)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，無腫脹，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞外膠原纖維結(jié)構(gòu)排列整齊，基質(zhì)中成纖維細(xì)胞形態(tài)正常，呈長梭形還可見纖維細(xì)胞突起（圖6）。

Ⅳ組：角膜上皮表面微絨毛部分恢復(fù)，但稀疏、短小，排列欠規(guī)則。細(xì)胞漿中線粒體輕度腫脹，呈橢圓形，嵴結(jié)構(gòu)可見，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列較整齊，細(xì)胞橋粒連接松散，細(xì)胞空泡變?nèi)悦黠@（圖7）?；|(zhì)中成纖維細(xì)胞基本正常，呈長梭形，核形規(guī)則，線粒體結(jié)構(gòu)正常（圖8）。

Ⅴ組（陰性對照組）：上皮微絨毛脫落，上皮細(xì)胞層缺損，且變薄，排列結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞膜受損，細(xì)胞間隙不清，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)紊亂不清?；|(zhì)層纖維排列紊亂、細(xì)胞局灶性溶解、壞死（圖9）。

Ⅵ（陽性對照組）：微絨毛稀疏，細(xì)胞層變薄，排列相對規(guī)則，上皮細(xì)胞局部有蟲蝕狀變性，細(xì)胞連接增寬，細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列欠整齊，細(xì)胞核皺縮，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清，部分仍有空泡變（圖10）。

Ⅶ組（空白組）：微絨毛脫落，上皮細(xì)胞變性壞死，上皮層受損至深部。基質(zhì)層局灶性撕裂，破損，溶解。纖維細(xì)胞變性、固縮、壞死，電子密度增高，胞漿空泡變，纖維細(xì)胞局灶性溶解（圖11）。

3 討論

目安眼膏與市售阿昔洛韋眼膏均含3%ACV，不同點(diǎn)是市售阿昔洛韋眼膏不含蜂蜜，與目安眼膏基質(zhì)不同。通過電鏡觀察，含5%蜂蜜的目安眼膏組用藥后兔角膜上皮表面微絨毛豐富，細(xì)胞層次排列規(guī)則，相互重疊的扁圓形細(xì)胞核，核型較規(guī)則，細(xì)胞器發(fā)達(dá)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，無腫脹，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞外膠原纖維結(jié)構(gòu)排列整齊，基質(zhì)中成纖維細(xì)胞形態(tài)正常。細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)恢復(fù)均優(yōu)于其它各組。表明含5%蜂蜜的目安眼膏可減輕阿昔洛韋藥物分子非靶向性對正常角膜上皮細(xì)胞的損害，保護(hù)角膜正常上皮，同時(shí)可加強(qiáng)網(wǎng)狀上皮細(xì)胞的吞噬能力。這可能與蜂蜜能增強(qiáng)免疫力，對創(chuàng)面有收斂、保護(hù)及愈合等作用有關(guān)。蜂蜜又是祖國醫(yī)學(xué)中制眼膏、丸藥的基質(zhì)，不與主藥起反應(yīng)，是配置眼膏的理想增強(qiáng)劑。

本實(shí)驗(yàn)表明蜂蜜與ACV配伍能增強(qiáng)對HSV-1的抑制作用，并有促進(jìn)角膜上皮修復(fù)、愈合、再生作用。目安眼膏蜂蜜的最佳濃度為5%。

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