復(fù)方健胰顆粒對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠白內(nèi)障防治作用研究

王曉玉 夏倫祝 高家榮 汪永忠 孟 楣 陳曉雯 馬鵬天

2安徽省中醫(yī)院內(nèi)分泌科

3安徽省中醫(yī)院眼科

隨著糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）患者日益增多，糖尿病性白內(nèi)障或白內(nèi)障伴有糖尿病者亦有增多趨勢(shì)〔1〕。研究糖尿病引起白內(nèi)障的發(fā)生、轉(zhuǎn)歸具有重要的臨床意義。越來越多的研究顯示，糖基化在糖尿病患者白內(nèi)障的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用〔2〕。晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycosylation end products，AGEs）是一類非酶催化的大分子糖基化產(chǎn)物。正常人體內(nèi)AGE的生成與清除處于平衡狀態(tài)，但由于糖尿病患者長(zhǎng)期處于高血糖水平，體內(nèi)AGE的生成異常增加并大量堆積，導(dǎo)致一系列病理變化，最終造成糖尿病慢性并發(fā)癥如白內(nèi)障等〔3〕。糖化血紅蛋白（HbA1c）是指血液中和葡萄糖結(jié)合了的一部分血紅蛋白，是反映慢性并發(fā)癥發(fā)生的重要指標(biāo)〔4〕。復(fù)方健胰顆粒是安徽省中醫(yī)院內(nèi)分泌科名老中醫(yī)在幾十年臨床經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上研發(fā)的醫(yī)院制劑。該方由黃芪、葛根、苦丁茶、丹參、荔枝核等多種中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰，化濁通絡(luò)的作用，主要用于治療2型糖尿病、代謝綜合癥及其引起的慢性血管并發(fā)癥等。本研究通過復(fù)方健胰顆粒作用于STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，以氨基胍 （aminoguanidine，AG）為陽性藥，觀察大鼠晶狀體的變化、血漿 HbA1c 及 HbA1（a＋b＋c）變化、血漿及晶狀體中AGEs的變化，初步探討其是否對(duì)糖尿病引起的白內(nèi)障具有預(yù)防和治療作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物

普通級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠80只（由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：皖實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第 01 號(hào)），體重為 150～180 g。在恒溫（22℃）、相對(duì)濕度65%～75%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)前，大鼠尾靜脈取血，血糖儀檢測(cè)血糖，排除血糖異常的大鼠；裂隙燈檢查，排除晶狀體及角膜異常的大鼠。最終符合實(shí)驗(yàn)要求的大鼠共60只。

1.2 藥品與試劑

STZ（SⅠGMA-S0130-1G，CAS Number：18883-66-4）；檸檬酸（AR，批號(hào)：T20090224，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；檸檬酸三鈉（AR，批號(hào)：F20081014，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；復(fù)方健胰顆粒（安徽省中醫(yī)院制劑中心提供，批號(hào)：20090205）；鹽酸氨基胍（TOKYO，東京化成工業(yè)株式會(huì)社，A1129，B53610B）；托吡卡胺滴眼液（武漢五景藥業(yè)有限公司，批號(hào)：09090201）；大鼠糖基化終產(chǎn)物（AGE）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（購(gòu)自美國(guó)R&D公司，編號(hào)DZE32545146）。

1.3 主要儀器

電子天平（Sartorius-BP211D 型）；pH 計(jì)（Sartorius-PB-20型）；冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)TGL-16G）；裂隙燈顯微鏡（瑞士HAAG-STRE-ⅠT 公司，型號(hào)：BD900）；血糖儀（Optium Xceed，美國(guó)Abbott Diabetes Care Ⅰnc.型號(hào)：XCE687-2107）；糖化血紅蛋白分析儀（美國(guó)伯樂公司，型號(hào)：BⅠO-RAD D-19，HPLC-離子交換色譜法）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司，型號(hào)：EL406）。

2 方法

2.1 STZ致糖尿病大鼠模型的制備

參照文獻(xiàn)方法〔5〕，以65 mg/kg的注射量對(duì)SD大鼠腹腔注射1%STZ枸櫞酸溶液（0.22 μm微孔過濾器過濾），同時(shí)向正常組大鼠腹腔注射等量的枸櫞酸溶液。72h后，取鼠尾靜脈血，血糖試紙測(cè)空腹血糖值。挑選血糖值穩(wěn)定并高于16.7 mmo1/L的大鼠備用。

2.2 動(dòng)物分組及給藥方案

大鼠隨機(jī)均分為5組：正常組、模型組、治療1組（2.5 g/kg，相當(dāng)于臨床每日給藥劑量的5倍），治療2組（5.0g/kg，相當(dāng)于臨床每日給藥劑量的10倍），AG組（0.1 g/kg），n=12。預(yù)防給藥：于造模成功后第1周至第8周分別連續(xù)灌胃（1 ml/100g）給藥，每日1次，正常組及模型組給予等量溶媒，連續(xù)8周。

2.3 1%STZ溶液制備

0.1 mol/L檸檬酸緩沖液的制備：A液：取枸櫞酸2.101 g，溶于100 ml蒸餾水；B液：取枸櫞酸三鈉2.941 g，溶 于100 ml蒸 餾 水 。 取A 液114 ml，B 液86 ml，混合均勻，pH計(jì)測(cè)實(shí)際 pH 值為4.25，用0.22 μm微孔過濾器過濾，即得，4℃保存。造模前，取1 g STZ溶于100 ml 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中混勻，即為1%STZ溶液，應(yīng)新鮮配制。

2.4 測(cè)試指標(biāo)及方法

①一般狀態(tài)的觀察：行為、狀態(tài)、體征、飲水量、攝食、尿量、體重等。②血糖變化：各組大鼠分別于造模前、造模后72h、造模后第8周末取各組鼠尾靜脈血，血糖試紙測(cè)血糖。③裂隙燈顯微鏡檢查并記錄大鼠晶狀體變化。按照何守志報(bào)道的方法將晶狀體混濁程度分為 0-Ⅴ期〔6〕：0 期：晶狀體透明；Ⅰ期：晶狀體周邊皮質(zhì)散在細(xì)小空泡；Ⅱ期：晶狀體周邊皮質(zhì)呈環(huán)狀密集中等空泡；Ⅲ期：除晶狀體周邊皮質(zhì)密集空泡外，部分皮質(zhì)片狀混濁；Ⅳ期：晶狀體核及核周皮質(zhì)混濁；Ⅴ期：晶狀體完全混濁。④HbA1c及HbA1（a＋b＋c）水平測(cè)定：股動(dòng)脈放血處死大鼠，抗凝管收集血漿，采用HPLC-離子交換色譜法，糖化血紅蛋白分析儀測(cè)定。⑤血漿及晶狀體中AGEs的含量檢測(cè)：股動(dòng)脈放血處死大鼠，收集血漿；立即摘取左眼眼球，分離晶狀體，用冷生理鹽水制成10%的晶狀體勻漿并離心（3 000 r/min），吸取上清液。按R&D公司提供的ELⅠSA試劑盒說明書對(duì)血漿及晶狀體中AGEs的含量進(jìn)行測(cè)定。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 一般形態(tài)學(xué)觀察

模型組大鼠于造模后，就出現(xiàn)典型的 “三多一少”癥狀，從第2周開始逐漸消瘦，體重與正常組大鼠相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且體毛脫落、性情易驚躁，多發(fā)四肢及尾部潰爛感染等癥，出現(xiàn)3只死亡現(xiàn)象，死亡率占25%。正常組大鼠隨時(shí)間增加體重增長(zhǎng)，生存狀態(tài)良好。經(jīng)藥物干預(yù)后，無論是治療1組和治療2組，還是陽性對(duì)照AG組，對(duì)大鼠體重的減輕均有不同程度的改善作用，且大鼠的生存狀態(tài)明顯優(yōu)于模型組。其中，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)治療1組大鼠體毛潔凈，攝食飲水量明顯減少，活潑好動(dòng)，死亡率僅為8.3%；治療2組死亡率占16.7%；AG組對(duì)體重也有改善作用，死亡率為8.3%（表1）。

表1 各組大鼠在不同時(shí)間的體重變化（±s，n=12）

表1 各組大鼠在不同時(shí)間的體重變化（±s，n=12）

注：①與正常組相比，P＜0.01；②與模型組相比，P＜0.05；③與模型組相比，P＜0.01。

3.2 裂隙燈顯微鏡觀察

給藥第8周末，裂隙燈顯微鏡記錄各組大鼠晶狀體變化情況。正常組大鼠晶狀體始終保持透明，為0期（圖1）；模型組大鼠晶狀體皮質(zhì)部呈現(xiàn)明顯片狀或劍竹狀向前極放射的結(jié)晶，為Ⅲ期，占41.2%，Ⅳ期混濁占35.3%，部分晶狀體完全混濁，為Ⅴ期，占23.5%（圖2）；治療1組大鼠晶狀體周邊皮質(zhì)散在細(xì)小空泡或中等空泡密集，為Ⅰ～Ⅱ期，分別占33.3%，Ⅲ期混濁占22.2%，Ⅳ期混濁占5.6%，Ⅴ期混濁占5.6%（圖3）；治療2組大鼠晶狀體呈現(xiàn)擴(kuò)大的條紋狀結(jié)晶，晶狀體核心尚透明，為Ⅲ期，占44.4%，Ⅳ期混濁占38.9%，Ⅴ期混濁占16.7%（圖4）；AG組大鼠晶狀體透明，為0期，占33.3%，Ⅰ期混濁占27.8%，Ⅱ期混濁占22.2%，Ⅲ期混濁占16.7%（圖5）。

表2 各組大鼠在第8周末時(shí)晶狀體的混濁程度

3.3 血糖及糖化血紅蛋白含量

給藥第8周末，股動(dòng)脈放血處死各組大鼠，血糖試紙測(cè)血糖；抗凝管收集各組大鼠血漿約5 ml，糖化血紅蛋白分析儀測(cè)定各組 HbA1a、HbA1b、HbA1c及HbA1（a+b+c）水平的變化。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組的血糖、HbA1c和HbA1（a+b+c）的含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，AG 組能顯著降低血糖（P＜0.05），對(duì)HbA1c 和 HbA1（a+b+c）的含量影響較小，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組相比，治療1組和治療2組差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但兩組均有緩慢降低血糖、HbA1c 及HbA1（a＋b＋c）含量的趨勢(shì)，且治療 1 組效果好于治療2組（表3）。

表3 各組大鼠在第8周末時(shí)糖化血紅蛋白及血糖情況（±s，n=9）

表3 各組大鼠在第8周末時(shí)糖化血紅蛋白及血糖情況（±s，n=9）

注：①與正常組相比，P＜0.01；②與模型組相比，P＜0.05。

3.4 血漿及晶狀體中AGEs含量

結(jié)果顯示，第8周末時(shí)，與正常組相比，模型組血漿及晶狀體中的AGEs的含量均顯著升高（P＜0.01），且晶狀體比血漿中的AGEs水平高得多；與模型組相比，治療1組和治療2組均能降低血漿及晶狀體中的AGEs的含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），治療 1 組效果更為明顯（表4）。

表4 各組大鼠在第8周末時(shí)血漿及晶狀體中AGEs 的含量 （±s，n=9）

表4 各組大鼠在第8周末時(shí)血漿及晶狀體中AGEs 的含量 （±s，n=9）

注：①與正常組相比，P＜0.01；②與模型組相比，P＜0.05； ③與模型組相比，P＜0.01。

4 討論

糖尿病繼發(fā)白內(nèi)障的發(fā)生與晶狀體蛋白過度糖基化、氧化應(yīng)激以及滲透壓等因素有著直接的關(guān)系〔7〕。越來越多的研究顯示，糖基化在糖尿病患者白內(nèi)障的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用〔8〕。蛋白糖基化是指蛋白質(zhì)的氨基組與糖的醛基組結(jié)合，首先形成不穩(wěn)定的schiff堿，再經(jīng)過分子重排，形成穩(wěn)定的AGEs。AGEs分子之間可以通過交聯(lián)形成大分子物質(zhì)，沉積在各種組織器官，從而導(dǎo)致組織器官包括眼晶狀體的病變〔9〕。

氨基胍（aminoguanidine，AG）是抑制 AGEs形成的一個(gè)經(jīng)典藥物〔10〕。AG對(duì)早期糖基化過程中Schiff堿基緩慢的化學(xué)重排也有一定抑制作用，同時(shí)還可抑制晶狀體蛋白糖基化生成的Amadori產(chǎn)物上碳?；姆磻?yīng)性，從而抑制晚期糖基化產(chǎn)物生成和蛋白質(zhì)交聯(lián)〔11，12〕。 有研究表明，AG 可抑制 STZ 糖尿病大鼠白內(nèi)障晶狀體內(nèi)的AGEs熒光產(chǎn)物的形成，延緩白內(nèi)障的發(fā)展〔13〕。

HbA1c是指血液中和葡萄糖結(jié)合了的一部分血紅蛋白，反映的是檢測(cè)前120d內(nèi)的平均血糖水平，不受空腹血糖以及胰島素治療等影響，是更直觀的對(duì)自身血糖水平情況的反映。許多研究均認(rèn)為〔14〕，糖化血紅蛋白的控制情況是否良好，與并發(fā)癥的發(fā)生概率有著一定的相關(guān)性。糖化血紅蛋白長(zhǎng)期高居不下的患者比一般血紅蛋白控制較為理想的患者發(fā)生并發(fā)癥的概率要高。有文獻(xiàn)報(bào)道，HbA1c每增加1%其慢性并發(fā)癥平均增加12%，HbA1c每下降1%，可以使糖尿病死亡的危險(xiǎn)下降21%，心臟病發(fā)作減少14%，微血管并發(fā)癥下降37%，周圍血管疾病減少43%。因此HbA1c也是反映慢性并發(fā)癥發(fā)生的重要指標(biāo)〔15〕。

因此，本研究選擇以上兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方健胰顆粒（2.5，5.0 g/kg）可以不同程度地降低DM大鼠的死亡率、提高生存質(zhì)量、減輕晶狀體混濁程度；能降低DM大鼠血漿及晶狀體中AGEs含量（P＜0.05），緩慢降低血糖、血漿中 HbA1c 及HbA1（a＋b＋c）的水平。說明復(fù)方健胰顆粒對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用，但不是像西藥如胰島素等，通過直接降低血糖來緩解癥狀，可能是通過中藥方益氣養(yǎng)陰，化濁通絡(luò)作用，來調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境，改善機(jī)體內(nèi)分泌功能。結(jié)果提示該作用可能與其減少血漿及晶狀體中AGEs水平有關(guān)，具體作用機(jī)制有待于下一步探索。

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