新癀片對急性胰腺炎大鼠胰腺細胞凋亡的影響

吳葆瑩 吳崇旭 薛承銳

·論著·

新癀片對急性胰腺炎大鼠胰腺細胞凋亡的影響

吳葆瑩 吳崇旭 薛承銳

目的觀察新癀片對急性胰腺炎(AP)大鼠胰腺細胞凋亡和胰腺組織Bcl-2、c-Myc蛋白表達的影響，并探討其作用機制。方法90只Wistar大鼠按完全隨機法分為對照組、AP組和新癀片治療組。采用膽胰管逆行注射5%牛黃膽酸鈉1 ml/kg體重方法制備AP模型。治療組于制模后30 min按480 mg/kg體重的劑量予新癀片水溶液灌胃。術(shù)后6、12、24 h分批處死大鼠，檢測血淀粉酶活性，觀察胰腺病理變化，TUNEL法檢測胰腺細胞凋亡，Western blotting法檢測胰腺組織Bcl-2、c-Myc蛋白表達。結(jié)果對照組12 h點的血淀粉酶活性、胰腺病理評分、凋亡指數(shù)、胰腺組織Bcl-2和c-Myc蛋白表達量分別為(1927±186)U/L、0、0.59±0.12、0.406±0.112、0.185±0.046；AP組分別為(5611±473)U/L、2.65±0.56、3.80±0.91、0.282±0.082、0.339±0.076；治療組分別為(4572±400)U/L、2.40±0.75、7.15±0.86、0.220±0.068、0.302±0.090。AP組和治療組的淀粉酶活性、胰腺病理評分、凋亡指數(shù)、c-Myc蛋白表達量均顯著高于對照組(P值均<0.05)，而Bcl-2蛋白表達量顯著低于對照組(P<0.05)。與AP組比較，治療組的淀粉酶活性、胰腺病理評分、胰腺組織Bcl-2蛋白表達量均顯著降低(P值均<0.05)，凋亡指數(shù)顯著增高(P<0.05)，c-Myc蛋白表達量無顯著變化。結(jié)論新癀片可通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達、誘導(dǎo)AP早期胰腺細胞凋亡，從而減輕胰腺炎癥反應(yīng)。

胰腺炎； 細胞凋亡; 新癀片； Bcl-2； c-Myc

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種發(fā)病急、并發(fā)癥多、進展快、病死率高的疾病，因此深入研究AP發(fā)病機制以及尋求有效的治療手段具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。本研究觀察中藥制劑新癀片對AP大鼠的保護作用，并探討其作用機制。

材料和方法

一、實驗分組

Wistar大鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心，批號SCXK津2008-0001，清潔級。按完全隨機法分為對照組、急性胰腺炎(AP)組和新癀片治療組，各30只。采用膽胰管逆行注射5%牛黃膽酸鈉1 ml/kg體重方法制備AP模型；對照組大鼠開腹后翻動十二指腸數(shù)次。治療組于制模后30 min按480 mg/kg體重的劑量予新癀片水溶液灌胃，對照組和AP組予等量蒸餾水灌胃。術(shù)后6、12、24 h分批處死大鼠。取血及胰腺組織。

二、方法

1．血淀粉酶檢測：應(yīng)用全自動生化分析儀。

2．胰腺病理學(xué)檢查：取部分胰腺組織，常規(guī)病理檢查。由病理科醫(yī)師盲法閱片。并參照Zhou等[1]的評分標(biāo)準進行評分。

3．胰腺細胞凋亡檢測：采用TUNEL法。每張切片計數(shù)7個高倍視野的陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)。凋亡指數(shù)(AI)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

4．胰腺組織Bcl-2和c-Myc蛋白檢測：采用 Western blotting法。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的吸光度積分值的比值表示蛋白相對表達量。

三、統(tǒng)計處理

結(jié) 果

一、一般情況

對照組狀況較好，無死亡。AP組有呼吸急促、豎毛、懶動、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、拒食等表現(xiàn)，術(shù)后死亡10只。治療組一般情況較AP組好，術(shù)后死亡5只，較AP組顯著降低(P<0.05)。

二、血清淀粉酶變化

AP組和治療組的血淀粉酶均較對照組顯著增高(P<0.05)，于6 h達峰值；治療組6、12 h的淀粉酶又較AP組同時點顯著降低(P<0.05，表1)。

三、胰腺病理變化

對照組胰腺結(jié)構(gòu)正常(圖1a)。AP組胰腺間質(zhì)水腫，炎細胞浸潤，腺泡小葉結(jié)構(gòu)破壞，胰腺組織出血、凝固性壞死及脂肪壞死(圖1b)。治療組較AP組上述病變有不同程度減輕，其中6 h組炎癥減輕最為明顯(P<0.05，圖1c)。各組胰腺病理評分見表1。

四、胰腺細胞凋亡變化

對照組罕見細胞凋亡(圖2a)。AP組6 h時凋亡細胞最多，以后顯著減少(P<0.05，圖2b)，AI值均顯著高于對照組(P<0.05，表1)。治療組凋亡細胞數(shù)較AP組增加，6、12 h的AI值有顯著差異(P<0.05，表1，圖2c)。

五、胰腺組織Bcl-2和c-Myc蛋白表達的變化

AP組Bcl-2蛋白表達較對照組顯著降低(P<0.05)；治療組6、12 h時的Bcl-2蛋白表達又較AP組顯著降低(P<0.05)。AP組c-Myc蛋白表達較對照組顯著增加(P<0.05)；治療組的c-Myc蛋白表達與AP組無顯著差異(表2，圖3)。

表1 各組淀粉酶、胰腺病理評分和凋亡指數(shù)的變化

注：與對照組比較，aP<0.05；與AP組比較，bP<0.05

表2 各組Bcl-2和c-Myc蛋白表達量的變化

注：與對照組比較：aP<0.05；與AP組比較，bP<0.05

圖1對照組(a)、AP組(b)和治療組(c)12 h的病理改變(HE ×200)

圖2對照組(a)、AP組(b)和治療組(c)12 h的細胞凋亡(TUNEL ×200)

1～3：對照組6、12、24 h；4～6：AP組6、12、24 h；7～9：治療組6、12、24 h

圖3Bcl-2和c-Myc蛋白的表達(Western blotting)

討 論

AP屬于中醫(yī)學(xué)“結(jié)胸”和“陽明腑實證”， 其病變關(guān)鍵是實熱血瘀，治療上以清熱解毒、活血化瘀和通腑瀉下為主[2-3]。新癀片是在傳統(tǒng)藥物“八寶丹”組方基礎(chǔ)上研制而成，其主要組分為腫節(jié)風(fēng)、田七、牛黃、珍珠層粉等，主治各種炎癥、痛癥[4]。其主要成分之一腫節(jié)風(fēng)，含有延胡索酸、黃酮苷內(nèi)酯等多種成分，具有清熱解毒、抗菌消炎的作用。另一主要成分田七具有活血化瘀、消腫止痛的功效。本研究結(jié)果顯示，新癀片治療組的淀粉酶活性顯著降低，胰腺組織損害明顯減輕，說明新癀片對緩解AP早期病程的進展具有較好的效果。

近年來的研究表明，細胞凋亡的程度與AP的嚴重程度呈負相關(guān)[5-6]。本結(jié)果顯示，AP組AI顯著高于對照組，以6 h時最高，治療組6、12 h時的AI值又較AP組同時間點顯著增加，表明新癀片能誘導(dǎo)AP早期胰腺細胞凋亡，從而減輕病情的嚴重程度。

細胞凋亡的發(fā)生機制非常復(fù)雜，其中Bcl-2及c-Myc蛋白均可誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。本實驗AP組的Bcl-2蛋白表達較對照組降低，c-Myc蛋白表達增加，新癀片治療后Bcl-2的表達更加降低，而c-Myc蛋白表達無明顯改變，提示新癀片可能是通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達誘導(dǎo)胰腺細胞發(fā)生凋亡的。

[1] Zhou X,Xue C.Ghrelin inhibits the development of acute pancreatitis and nuclear factor kappa B activation in pancreas and liver.Pancreas,2009,38:752-757.

[2] 胡占良,呂志武,張新宇,等.參附注射液對急性壞死性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障保護作用的研究.中華胰腺病雜志,2008,8:24-27.

[3] 姚圣華,朱陽春,李淑德.清胰湯及生大黃灌腸治療重癥急性胰腺炎最佳應(yīng)用時間探討.中華胰腺病雜志,2008,8:324-325.

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[5] Fortunato F,Bürgers H,Bergmann F,et al.Impaired autolysosome formation correlates with Lamp-2 depletion:role of apoptosis,autophagy,and necrosis in pancreatitis.Gastroenterology,2009,137:350-360.

[6] Li ZD,Ma QY,Luo YH.Expression of survivin gene in a rat model of acute pancreatitis.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao,2009,29:1141-1143.

2009-12-12)

(本文編輯：屠振興)

EffectofXinhuangPianonpancreaticapoptosisinratwithacutepancreatitis

WUBao-ying,WUChong-xu,XUECheng-rui.

DepartmentofSurgeryIntegratedTraditionalandWesternMedicine,GeneralHospital,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300052,China

Correspondingauthor:WUChong-xu,Email:0e25@sina.com

ObjectiveTo investigate the effect of Xinhuang Pian on pancreatic apoptosis and the protein expression of Bcl-2 and c-Myc in rat with acute pancreatitis (AP).Methods90 Wister rats were randomly divided into 3 groups, including control group, AP group and Xinhuang Pian treatment (XP )group. AP model was induced by pancreaticobiliary injection of 5% sodium taurocholate (1 ml/kg weight). Rats in XP group were given Xinhuang Pian solution (480 mg/kg weight) lavage 30min after AP induction, The rats were sacrificed at 6,12, 24 h after AP induction, and serum amylase levels were determed, pancreatic pathological change was observed; apoptosis was determined by TUNEL method. The determination of Bcl-2 and c-Myc protein expression was performed by Western blot.Results12 h after AP induction, serum amylase, pancreatic pathological scores, apoptotic indexes and the protein expression of Bcl-2 and c-Myc were (1927±186)U/L, 0, 0.59±0.12, 0.406±0.112, 0.185±0.046 in control group; (5611±473)U/L, 2.65±0.56, 3.80±0.91, 0.282±0.082, 0.339±0.076 in AP group; and (4572±400)U/L, 2.40±0.75, 7.15±0.86, 0.220±0.068, 0.302±0.090 in XP group. The levels of serum amylase, pancreatic pathological scores, apoptotic indexes and the protein expression of c-myc in AP and XP group were all significantly higher than those in control group (P<0.05), while the protein expression of Bcl-2 was significantly lower than that in control group (P<0.05). Compared with AP group, the levels of serum amylase, pancreatic pathological scores, protein expression of Bcl-2 were all significantly lower in XP group (P<0.05), but the apoptotic indexe was significantly higher (P<0.05), and there was no significant change of expression of c-Myc protein.ConclusionsXinhuang Pian may induce the pancreatic apoptosis through down-regulating Bcl-2 protein expression, and result in the alleviation of pancreatic inflammatory reaction.

Pancereatitis; Apoptosis; Xinhuang Pian; Bcl-2; c-Myc

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.03.012

300052 天津，天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合外科(吳葆瑩、薛承銳)，急診科(吳崇旭)

吳崇旭，Email:0e25@sina.com