吡格列酮對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺PPARγ mRNA表達(dá)的影響

徐萍 李清華 王靜 徐凱 姜景平 陳令全

·論著·

吡格列酮對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺PPARγ mRNA表達(dá)的影響

徐萍 李清華 王靜 徐凱 姜景平 陳令全

目的觀察過氧化物酶增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator-activated receptors，PPARγ)激動(dòng)劑吡格列酮對(duì)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠PPARγ mRNA表達(dá)的影響。方法54只SD大鼠按完全隨機(jī)法分成假手術(shù)組、ANP組、吡格列酮組。采用?；悄懰徕c逆行胰膽管內(nèi)注射建立ANP模型，于造模后3、6、12 h檢測(cè)血清淀粉酶含量，觀察胰腺病理學(xué)改變，并采用RT-PCR法檢測(cè)胰腺組織PPARγ mRNA的表達(dá)。結(jié)果ANP組6 h點(diǎn)的血清淀粉酶及胰腺組織病理學(xué)評(píng)分分別為(7171±1636)U/L和13.00±2.36，均較假手術(shù)組的(523±166)U/L和1.67±2.34顯著增高(P<0.01)，而PPARγ mRNA在兩組中表達(dá)均較弱，無顯著差異(0.18±0.05對(duì)0.22±0.03，P>0.05)；吡格列酮組6 h的血清淀粉酶水平、胰腺病理學(xué)評(píng)分分別為(4504±1901)U/L和9.00±0.89，均較ANP組明顯下降(P<0.05)，PPARγ mRNA表達(dá)較ANP組增強(qiáng)(0.56±0.05對(duì)0.18±0.05，P<0.05)。結(jié)論吡格列酮對(duì)ANP大鼠的保護(hù)作用可能與上調(diào)PPARγ基因的表達(dá)密切相關(guān)。

胰腺炎，急性壞死性； 過氧化物酶體激活物受體； 吡格列酮

過氧化物酶增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator-activated receptors，PPARγ)是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，主要參與細(xì)胞的增殖、分化以及糖脂代謝的平衡。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動(dòng)劑能夠明顯抑制炎癥反應(yīng)，然而其對(duì)重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)的作用機(jī)制仍不十分清楚。因此，本文觀察PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮對(duì)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠PPARγ mRNA表達(dá)的影響，探討其抗炎機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SD大鼠54只，清潔級(jí)，鼠齡2～2.5個(gè)月，體重160～200 g，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)科部提供。按完全隨機(jī)法分為假手術(shù)組、ANP組和吡格列酮組，各18只。以胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c溶液1 ml/kg體重(Sigma公司)制備ANP模型；吡格列酮組在制模前2 h腹腔注射吡格列酮50 mg/kg體重(成都宇洋高科技發(fā)展公司)；假手術(shù)組開腹后以鈍器輕劃胰腺3次。術(shù)后3、6、12 h腹主動(dòng)脈取血，分離取血清；留取胰腺組織，部分于10%中性甲醛固定，部分置液氮罐保存。

二、指標(biāo)的測(cè)定

1．血清淀粉酶：采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

2．胰腺組織病理學(xué)檢查：胰腺固定標(biāo)本采用常規(guī)病理學(xué)檢查，并按照Schmidt等[1]標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。

3．胰腺組織PPARγmRNA表達(dá)檢測(cè)：采用RT-PCR法。應(yīng)用Trizol(Promega公司)抽提總RNA。PPARγ(642 bp)上游引物5′-TGACCACTCCCATTCCTTTG-3′，下游引物5′-TTTCCTGTCAAGATCGCCCT-3′；β-actin (228 bp)上游引物5′-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3′，下游引物5′-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3′。引物由上海杰瑞基因技術(shù)公司合成。PCR條件：95℃ 5 min，95℃ 1 min、53℃(PPARγ)或55℃(β-actin)1 min、72℃ 1 min，29個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，圖像分析軟件掃描，以PPARγ/β-actin比值表示mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、血清淀粉酶的變化

ANP組血清淀粉酶活性于術(shù)后3 h急劇上升，6 h達(dá)峰值，顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)；吡格列酮組血清淀粉酶含量較ANP組同時(shí)點(diǎn)均降低，其中6、12 h降低顯著(P值均<0.05，表1)。

二、胰腺組織病理學(xué)改變

假手術(shù)組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，腺泡小葉完整，偶見間質(zhì)區(qū)輕度水腫(圖1a)；ANP組胰腺水腫，部分腺泡呈孤島狀，伴大片腺泡細(xì)胞壞死，胰腺實(shí)質(zhì)及間質(zhì)內(nèi)見大量紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞浸潤(圖1b)，病理評(píng)分較假手術(shù)組明顯升高(P<0.01)；吡格列酮組鏡下表現(xiàn)較ANP組減輕(圖1c)，6、12 h的病理評(píng)分較ANP組明顯降低(P<0.05，表1)。

表1 各組血清淀粉酶及胰腺病理評(píng)分的變化

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與ANP組比較，bP<0.05

圖1假手術(shù)組(a)、ANP組(b)和吡格列酮組(c)12 h的胰腺病理改變(HE ×200)

三、胰腺組織PPARγ mRNA表達(dá)的變化

假手術(shù)組和ANP組PPARγ mRNA表達(dá)均較弱，兩組無明顯差異(P>0.05)；吡格列酮組PPARγ mRNA表達(dá)較假手術(shù)組及ANP組均明顯增強(qiáng)(P值均<0.05，表2、圖2)。

1：假手術(shù)組；2：ANP組；3～5：吡格列酮組(3、6、12 h組)

組別只數(shù)術(shù)后3h6h12h假手術(shù)組60.23±0.040.22±0.030.20±0.04ANP組60.21±0.030.18±0.050.15±0.03吡格列酮組60.40±0.03ab0.56±0.05ab0.65±0.04ab

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

討 論

PPAR有三種表型：PPARα、PPARβ、PPARγ，其中PPAR-γ的研究最為深入。PPARγ激動(dòng)劑可抑制NF-κB、AP-1等信號(hào)的活化，降低促炎因子、黏附分子表達(dá)以及環(huán)氧合酶、一氧化氮合酶、基質(zhì)金屬蛋白酶-9的活性，負(fù)性調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[2-3]。目前認(rèn)為，PPARγ激動(dòng)劑可能通過PPARγ依賴和非依賴性途徑，從不同水平調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多條涉及炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)抗炎作用。PPARγ依賴性機(jī)制可能包括：(1)直接與NF-κBp65/p50結(jié)合形成復(fù)合物，降低NF-κB的DNA結(jié)合活性，抑制下游靶基因的表達(dá)；(2)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合NF-κB、AP-1的輔助活化因子，阻止這些轉(zhuǎn)錄因子的激活；(3)抑制IκB激酶，阻止IκB的降解；(4)降低JNK活性，減少AP-1的活化[4-5]。PPARγ非依賴性途徑目前不太清楚。

近年來，PPARγ激動(dòng)劑已被廣泛應(yīng)用于急性胰腺炎(AP)的實(shí)驗(yàn)研究，它對(duì)AP的保護(hù)作用得到不斷地驗(yàn)證，有望成為一種治療AP的嶄新手段。Cuzzocrea等[6]采用羅格列酮干預(yù)雨蛙素誘導(dǎo)的AP小鼠，其胰腺組織中性粒細(xì)胞的浸潤、ICAM-1和硝基酪氨酸的表達(dá)均較AP組顯著下降。Hashimoto等[7]報(bào)道，PPARγ天然激動(dòng)劑-15d-PGJ2可明顯減輕AP大鼠的胰腺組織損傷，減少IL-6的釋放及COX-2的表達(dá)，并抑制IκB蛋白的降解。Konturek等[8]研究顯示，吡格列酮對(duì)AP的抗炎作用呈劑量依賴性，并可促進(jìn)熱休克蛋白-70的表達(dá)。我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)，吡格列酮能有效減輕ANP大鼠胰腺組織病理損傷，降低胰腺NF-κBp65/p50和ICAM-1蛋白的表達(dá)[9]。

然而，PPARγ激動(dòng)劑在AP中的作用機(jī)制至今尚未完全闡明。有研究者發(fā)現(xiàn)，AP可導(dǎo)致胰腺組織中PPARγ蛋白表達(dá)下降，而15d-PGJ2能促進(jìn)PPARγ蛋白表達(dá)，認(rèn)為PPARγ激動(dòng)劑表現(xiàn)出的抗炎特性有賴于PPARγ的參與[10]。有研究顯示，炎癥因子TNF-α、IL-1β可抑制PPARγ mRNA表達(dá)，而應(yīng)用PPARγ激動(dòng)劑則可使PPARγ 基因的轉(zhuǎn)錄恢復(fù)到正常水平，從而發(fā)揮調(diào)控炎癥反應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,大鼠ANP胰腺組織中PPARγ mRNA的表達(dá)略下降，應(yīng)用吡格列酮干預(yù)后則可明顯增強(qiáng)PPARγ mRNA的表達(dá)，同時(shí)血清淀粉酶含量與胰腺組織學(xué)評(píng)分顯著降低。因此，我們推測(cè)吡格列酮可能是通過上調(diào)PPARγ基因表達(dá)而發(fā)揮對(duì)胰腺炎的保護(hù)性作用。

[1] Schmidt J,Rattner DW,Lewandrowski K,et al.A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy.Ann Surg,1992,215:44-56.

[2] Abdelrahman M,Sivarajah A,Thiemermann C.Beneficial effects of PPAR-gamma ligands in ischemia-reperfusion injury,inflammation and shock.Cardiovasc Res,2005,65:772-781.

[3] Imamoto E,Yoshida N,Uchiyama K,et al.Inhibitory effect of pioglitazone on expression of adhesion molecules on neutrophils and endothelial cells.Biofactors,2004,20:37-47.

[4] Jennewein C,Kuhn AM,Schmidt MV,et al.Sumoylation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma by apoptotic cells prevents lipopolysaccharide-induced NCoR removal from kappaB binding sites mediating transrepression of proinflammatory cytokines.J Immunol,2008,181:5646-5652.

[5] Hamblin M,Chang L,Fan Y,et al.PPARs and the cardiovascular system.Antioxid Redox Signal,2009,11:1415-1452.

[6] Cuzzocrea S,Pisano B,Dugo L,et al.Rosiglitazone, a ligand of the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma,reduces acute inflammation.Eur J Pharmacol,2004,483:79-93.

[7] Hashimoto K,Ethridge RT,Saito H,et al.The PPAR-gamma ligand,15d-PGJ2,attenuates the severity of cerulein-induced acute pancreatitis.Pancreas,2003,27:58-66.

[8] Konturek PC,Dembinski A,Warzecha Z,et al.Pioglitazone,a specific ligand of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma,protects pancreas against acute cerulein-induced pancreatitis.World J Gastroenterol,2005,11:6322-6329.

[9] Xu P,Zhou XJ,Chen LQ,et al.Pioglitazone attenuates the severity of sodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis.World J Gastroenterol,2007,13:1983-1988.

[10] Rollins MD,Sudarshan S,Firpo MA,et al.Anti-inflammatory effects of PPAR-gamma agonists directly correlate with PPAR-gamma expression during acute pancreatitis.J Gastrointest Surg,2006,10:1120-1130.

[11] Rollins MD,Sudarshan S,Firpo MA,et al.Anti-inflammatory effects of PPAR-gamma agonists directly correlate with PPAR-gamma expression during acute pancreatitis.J Gastrointest Surg,2006,10:1120-1130.

2010-02-08)

(本文編輯：屠振興)

EffectofpioglitazoneonPPARγmRNAexpressioninratswithacutenecrotizingpancreatitis

XUPing,LIQing-hua,WANGJing,XUKai,JIANGJing-ping,CHENLing-quan.

DepartmentofGastroenterology,SongjiangHospital,MedicalShchool,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai201600,China

XUPing,Email:yfyxp@yahoo.com.cn

ObjectiveTo observe the effect of pioglitazone on peroxisome proliferators activated receptors (PPARγ) mRNA expression in rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP).Methods54 rats were randomly divided into sham group, ANP group, and pioglitazone group. ANP was induced by the retrograde injection of sodium taurocholate into pancreatic duct. The levels of serum amylase at 3 h, 6 h, and 12 h after ANP induction were determined and pancreatic pathological scores were measured, and the expression of pancreatic PPARγ mRNA was determined by RT-PCR.ResultsThe levels of serum amylase and pancreatic pathological scores at 6 h in ANP group were (7171±1636)U/L and 13.00±2.36; which were significantly higher than those in sham group [(523±166)U/L and 1.67±234,P<0.01]. While the expressions of PPARγ mRNA were weakly expressed in ANP gyoup and sharm group(0.18±0.05vs0.22±0.03,P>0.05). The levels of serum amylase and pancreatic pathological scores at 6 h in pioglitazone group were (4504±1901)U/L and 9.00±0.89, which were significantly lower than those in ANP group (P<0.05). While the expressions of PPARγ mRNA was higher than that in ANP group (0.56±0.05vs0.18±0.05,P<0.05).ConclusionsThe protective role of pioglitazone on ANP rats was closely correlated with up-regulation of PPARγ gene expression.

Pancreatitis, acute necrotizing; Peroxisome proliferator-activated receptors; Pioglitazone

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.016

201600 上海，上海交通大學(xué)附屬上海市第一人民醫(yī)院松江分院消化內(nèi)科

徐萍，Email：yfyxp@yahoo.com.cn